木薯MeEIN3.1基因克隆及其在采后生理性變質中的信號轉導

賴錦濤, 楊靜琳, 羅佳科, 陳志晟, 葉曉雪, 顏 彥, 曾 堅, 胡 偉

(1.韶關學院廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室,廣東 韶關 512005;2.韶關學院生物與農業學院,廣東 韶關 512005;3.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所,海南 ?？?571101)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是世界三大薯類作物之一,也是熱區重要的糧食作物和經濟作物,全球約有7億人口以木薯為主糧[1-2]。木薯在中國的廣西、廣東和海南地區是一種重要的經濟作物[3],也是具有重大發展潛力的綠色能源作物,其淀粉可用于生產燃料乙醇和工業淀粉[3-4]。然而,木薯塊根采收后不能長時間存儲,容易出現“采后生理性變質”(post-harvest physiological deterioration, PPD)的現象,這嚴重阻礙了木薯塊根的大規模生產加工[5-6]。乙烯作為植物中的重要激素,在植物的生長發育和脅迫響應中起著重要作用[7-10]。例如,當植物缺水時,乙烯的含量會迅速增加,導致葉片衰老加速并脫落,以平衡植株的含水量[11]。另外,使用乙烯前體處理擬南芥幼苗可以提高植株對鹽脅迫的耐受能力[12]。乙烯信號和活性氧含量的變化也有關系[13-14]。例如,在梨中,乙烯通過提高超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性可以抑制采后腐爛[15]。乙烯還可以通過提高擬南芥氣孔保衛細胞中的NADPH氧化酶來介導活性氧的產生,從而促使氣孔關閉[13]。在擬南芥中鑒定得到的乙烯信號轉導通路,主要由乙烯受體(ethylene receptors)、CTR1蛋白激酶(raf-like CTR1)、EIN2(ethylene insensitive 2)、EIN3(ethylene insensitive 3)/EIL1(ethylene insensitive-like1)、ERF1(ethylene response factor 1)以及EBF1/2(EIN3 binding F-box 1 and 2)等關鍵組分組成[16-18]。Rothenberg et al[19]在擬南芥中首次獲得了ein3突變體,隨后克隆了EIN3基因及其同源基因EIL1(EIN3-like1)和EIL2。EIN3/EIL1是乙烯信號途徑中起正調控作用的信號因子。當EIN3/EIL1在信號通路中積累時,以同源二聚體的形式與ERF1轉錄因子結合,從而開始初級乙烯響應。激活的ERF1轉錄因子可以進一步放大傳遞信號并與相關的非生物脅迫響應基因結合,調控次級乙烯響應基因的表達[20-22]。ERF1是乙烯信號轉導通路中重要的下游轉錄因子,調控下游目標基因的信號傳遞[8-10]。在擬南芥中,AtEIN3在乙烯應答中起調控作用[18]。乙烯信號通過EIN3/EIL1調控不同基因,例如EIN3調控幼苗的乙烯反應,而EIL1抑制植株莖的伸長和葉片的生長[19,23]。因此,EIN轉錄因子是乙烯信號轉導途徑中的重要組成部分。研究結果表明,木薯PPD的發生與活性氧的大量積累有關[24]。本實驗室的前期研究發現,通過乙烯處理可以明顯抑制木薯塊根的PPD過程,并且發現木薯塊根中的抗氧化酶活性顯著提高,推測通過提高木薯塊根中的抗氧化酶活性可以抑制PPD過程。然而,至今尚無關于木薯乙烯信號通路中相關基因的克隆及其在木薯PPD過程中作用的報道。因此,本研究通過挖掘前期木薯PPD過程的轉錄組數據,利用RT-PCR技術克隆了MeEIN3.1基因,并對其編碼的蛋白質序列進行了生物信息學分析,同時對MeEIN3.1在PPD過程中的表達模式進行了分析,為進一步研究MeEIN3.1基因在PPD過程中的功能和信號轉導提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木薯品種為華南8號(中國熱帶農業科學院種植并提供)。DNA回收純化試劑盒、質粒提取試劑盒、pMD18-T載體、熒光定量PCR反應試劑、Nimble Cloning克隆試劑盒、反轉錄試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;大腸桿菌DH5α感受態細胞和農桿菌GV3101感受態細胞購自諾唯贊生物科技有限公司;2×TaqMaster Mix酶和T4連接酶購自海南壹田生物科技有限公司,亞細胞定位載體pNC-Green-SubC為本實驗室保存,限制性核酸內切酶購自Thermo Fisher Scientific公司。主要儀器設備:超微量紫外分光光度計(Thermo,美國),PCR儀(耶拿,德國),EPS300電泳儀(Tanon,上海),CT15RT高速冷凍離心機(Techcomp,中國),4100凝膠成像儀(Tanon,上海),FluoView FV1000激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯,日本),MX3000熒光定量PCR儀(安捷倫,美國)。

1.2 材料處理

采摘大田種植10個月的成熟木薯,選取外表皮沒有破損的木薯塊根,將其切下3～4片(直徑約4 cm,厚度4～5 mm),并放在托盤中。設置溫度為26 ℃,相對濕度為75%,晝夜長短分別為16 h/8 h的恒溫培養箱中,不同處理時間點(0、6、12、48 h)收集塊根樣品(重復3次),塊根樣品液氮處理后置于-80 ℃。

1.3 基因克隆和亞細胞定位

根據MeEIN3.1基因的核苷酸序列設計引物,并進行基因擴增(表1)。擴增得到目標基因片段后,將其連接至pMD18-T載體上,并進行測序。將測序正確的菌液和陽性克隆質粒保存。隨后,使用Nimble Cloning方法將目標基因連接到pNC-Green-SubC載體上,將獲得的表達載體命名為pNC-Green-SubC-MeEIN3.1。經過測序確認無誤后,將pNC-Green-SubC-MeEIN3.1和空載對照分別轉化至農桿菌GV3101感受態細胞中。轉化后,將其侵染煙草葉片并在25 ℃下培養72 h。制片后,使用Fluo View FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號在煙草葉片細胞中的分布情況。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.4 生物信息學分析

利用在線網站ExPASy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析MeEIN3.1基因編碼蛋白的理化性質。利用在線工具SOPMA和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)進行結構預測。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中進行保守結構域分析。采用BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Phytzome數據庫(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)搜索及比對分析同源序列,以MEGA-X中的MUSCLE方法進行序列比對,使用Neighbor-joining法構建系統發育樹,Bootstrap值設置為1 000。利用Wolf Psort網站(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細胞定位預測。

1.5 基因表達分析

根據MeEIN3.1序列設計熒光定量引物(表1),以MeTUB基因作為內參基因,采用實時熒光定量PCR分析MeEIN3.1基因在木薯PPD過程中的表達情況(3次生物學重復)。使用2-ΔΔCt法計算MeEIN3.1基因的相對表達量。

1.6 酵母雙雜交

根據相關基因按照上下游互作關系分別構建到pGADT7和pGBKT7載體中,并提取陽性重組克隆菌液的質粒。以pGADT7-T和pGBKT7-53作為陽性對照,pGADT7-T和pGBKT7-Lam作為陰性對照,將陽性對照質粒組合、陰性對照質粒組合以及構建的重組質粒組合兩兩轉化到AH109酵母感受態中進行培養,觀察基因編碼蛋白的互作情況(表1)。從互作組合的SD/-Leu/-Trp-/His/X-α-Gal培養基上挑取藍色菌落,將其轉移到經過滅菌的200 μL PCR管中,加入100 μL無菌ddH2O并充分混合后吸取2 μL重新接種到SD/-Leu/-Trp-His中,28 ℃培養96 h。再次觀察結果,并對再次變藍的互作組合進行圖像保存。

2 結果與分析

2.1 MeEIN3.1基因

在Phytzome數據庫中,將擬南芥AtEIN3基因(AT3G20770)的核苷酸序列和木薯基因組進行blast比對,得到6個屬于EIN3/EIL1家族的木薯序列。根據實驗室前期對木薯塊根在采后0、12、24、48 h的轉錄組測序結果進行分析,發現其中屬于EIN3/EIL1家族基因的序列Manes.13G091600.1受到顯著誘導。對Manes.13G091600.1的序列進行引物設計并進行RT-PCR擴增,得到1個1 452 bp的片段 (圖1),經過測序發現該基因編碼483個氨基酸殘基,命名為MeEIN3.1基因。MeEIN3.1蛋白預測的分子式為C2405H3745N669O766S26,理論等電點為5.08,分子質量55.12 ku,不穩定系數為54.58,預測為不穩定蛋白。將MeEIN3.1基因序列與木薯基因組進行比對發現,該基因不包含內含子,只有1個外顯子。對MeEIN3.1蛋白序列進行二級結構預測顯示,α-螺旋占比40.79%,β-轉角占比7.25%,無規則卷曲占比為40.58%,延伸鏈占比11.39%。對MeEIN3.1蛋白序列進行三級結構預測(圖2),其含有EIN3家族結構域(圖3)。以上預測分析結果證明,克隆得到的MeEIN3.1基因屬于EIN3/EIL1基因家族的成員。

M:DNA maker;1:樣品;2:模板為水。

圖3 結構域分析Fig.3 Analysis of conserved domain

2.2 MeEIN3.1氨基酸序列同源性和系統發育

在NCBI數據庫中,將MeEIN3.1基因的蛋白序列進行blast比對,發現了其他物種中與MeEIN3.1基因蛋白序列相似性較高的基因(一致性大于50%),其中與橡膠樹中的EIN3-like基因(XP_021687399.1)的一致性最高,達到69.35%。從圖4可以看出,MeEIN3.1蛋白序列和其他EIN3蛋白序列一致性不高,但它們都包含EIN3/EIL1基因家族的結構特征。EIN3/EIL1基因家族的N端具有高度保守性,包含多個保守的EIN3結構域,如酸性氨基酸區(AD)、堿性氨基酸簇(BD Ⅰ、BD Ⅱ、BD Ⅲ、BD Ⅳ、BD Ⅴ)以及脯氨酸富集區(PR),而C端的保守性較低。這些結果證明,MeEIN3.1屬于EIN3/EIL1基因家族,與橡膠樹中的EIN3-like基因(XP_021687399.1)相似性最高,在同一進化分支上(圖5),都屬于大戟科植物。

MeEIN3.1木薯;XP_021687399.1橡膠樹;XP_002533137.1蓖麻;XP_022752027.1榴蓮;AVR43713.1陸地棉;XP_027337569.1紅豆;XP_040874091.1大豆;KHN29080.1野生大豆;XP_011090514.1芝麻;XP_022929461.1南瓜;XP_022984791.1印度南瓜。

*表示MeEIN3.1蛋白。

2.3 MeEIN3.1蛋白亞細胞定位

亞細胞在線預測軟件Softberry和WoLF PSORT servers的預測結果顯示,MeEIN3.1蛋白定位于細胞核。隨后,將MeEIN3.1基因的CDS序列連接至載體pNC-Green-subC,構建了pNC-Green-subC-MeEIN3.1植物表達載體。通過農桿菌侵染的方法,在煙草葉片中進行了亞細胞定位試驗。結果表明,綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)在細胞核中表達,說明轉錄因子MeEIN3.1定位于細胞核(圖6)。

圖6 MeEIN3.1蛋白亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of MeEIN3.1 protein

2.4 MeEIN3.1基因在PPD過程中的表達

為研究MeEIN3.1基因在木薯PPD過程中的功能,對MeEIN3.1基因在木薯塊根PPD不同階段的表達情況進行了分析。結果表明(圖7),MeEIN3.1基因的表達量在PPD過程中呈現上調的趨勢;和0 h相比,在6、12、48 h分別提高了1.7、4.5、6.7倍。表明MeEIN3.1基因的表達在木薯PPD過程中受到誘導,推測其在PPD調控過程中發揮了作用。

*代表與0 h差異顯著(P<0.05)。

2.5 酵母雙雜交互作試驗

乙烯信號通路中積累的EIN3/EIL1能以同源二聚體的形式與ERF1轉錄因子相結合開始乙烯信號響應,因此,本試驗運用酵母雙雜交試驗鑒定MeEIN3.1基因與乙烯信號通路下游關鍵轉錄因子ERF之間的互作關系。將MeEIN3.1基因和實驗室已克隆得到并在PPD過程中被顯著誘導的4個木薯MeERFs轉錄因子構建到pGADT7和pGBKT7載體中,并擴增得到重組質粒。根據EIN3/EIL1與ERFs的互作關系驗證結果(圖8),所有組合在DDO培養基上正常生長。在TDO培養基上,MeEIN3.1+MeERF1.2、MeEIN3.1+MeERF1.3和陽性對照pGADT7-T+pGBKT7-5形成了菌落,并在X-α-Gal染料下呈現出藍色,2個試驗組合的生長狀態和染色程度與陽性對照類似;而MeEIN3.1+MeERF1.1和MeEIN3.1+MeERF1.4組合及pGADT7-T+pGBKT7-Lam陰性對照則無菌落產生。初步推測MeEIN3.1與下游轉錄因子MeERF1.2和MeERF1.3存在互作。

3 討論

EIN3/EIL1是乙烯信號途徑中起正調控作用的信號因子,是乙烯信號轉導通路中的主要成員,不同物種中的EIN3/EIL1數量各不相同。對EIN3/EIL1的功能進行分析研究,能夠進一步解析乙烯信號轉導通路及其功能,具有重要意義[16-18]。實驗室前期的轉錄組數據顯示MeEIN3.1基因在木薯塊根PPD過程中被顯著誘導。因此,本試驗從木薯中克隆了MeEIN3.1基因,MeEIN3.1基因的蛋白質序列顯示含有483個氨基酸殘基,保守結構預測顯示含有EIN3家族結構域,具有多個保守的EIN3結構域,可以確定該基因屬于EIN3/EIL1基因家族。亞細胞定位結果顯示MeEIN3.1蛋白定位于細胞核,符合轉錄因子的功能定位[19]。進化關系顯示MeEIN3.1和橡膠樹EIN3蛋白的進化關系較近。這些結果都證明MeEIN3.1基因屬于植物EIN3/EIL1家族。

木薯是重要的糧食和經濟作物之一,但PPD現象影響了其在規?；a中的利用。本課題組的前期研究表明,乙烯處理能夠延緩木薯塊根PPD現象的進程。MeEIN3.1基因與乙烯信號途徑密切相關,其深入研究對探明乙烯信號調控木薯PPD的分子機制具有重要意義?，F有研究顯示EIN3/EIL1基因家族參與了不同非生物逆境脅迫的響應,例如干旱和鹽脅迫等[2,4,12]。乙烯信號的轉導和果實的成熟密切相關。在番茄和香蕉中研究顯示,EIN3/EIL1作為乙烯信號轉導途徑的重要成員,在啟動調控乙烯目標基因的過程中發揮重要作用[25-27]。木薯塊根PPD現象的發生往往伴隨著活性氧的大量產生,因此,降低活性氧的含量能夠延緩PPD過程[24,28]。擬南芥AtEIN3基因可以通過正向調控過氧化物酶基因POD的表達以減少活性氧的積累,進而提高植株的耐鹽性[29]。而MeEIN3.1基因在PPD過程中的表達顯著受到誘導,并且在乙烯處理塊根的過程中也顯著被誘導。因此,推測乙烯調控抗氧化系統信號的轉導是通過MeEIN3.1基因進行的。ERF1是乙烯信號通路中重要的轉錄因子,負責將信號轉導至下游目標調控基因,在生長發育、應激反應等多種生物學過程中起著重要調控作用[8-10]。有研究表明,積累在乙烯信號通路中的EIN3/EIL1可以通過與轉錄因子ERF1相結合來啟動乙烯響應[20-22]。酵母雙雜交試驗顯示,MeEIN3.1與MeERF1.1和MeERF1.4的組合在TDO缺陷培養基上不能正常生長,而MeEIN3.1與MeERF1.2和MeERF1.3的組合在TDO缺陷培養基上可以正常生長且菌落呈藍色,因此推測MeEIN3.1很可能是通過下游關鍵轉錄因子MeERF1.2和MeERF1.3進行信號轉導的[10]。MeEIN3.1定位于細胞核也證明其具備與其他轉錄因子互作的條件。由此推測,MeEIN3.1基因參與了乙烯信號在木薯PPD過程中的轉導。以上結果為進一步研究乙烯信號如何延緩PPD過程提供了參考,并為培育高抗PPD過程的木薯新品種提供了方向。

致謝：感謝李丹丹女士在論文撰寫過程中的校對工作。