利用南瓜蒸煮液綠色制備納米銀及其抑菌性能的研究

高大響，楊鶴同

利用南瓜蒸煮液綠色制備納米銀及其抑菌性能的研究

高大響*，楊鶴同

（江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 212400）

以南瓜蒸煮液和AgNO3為原料，烷基糖苷（APG）為表面活性劑，以微波加熱綠色制備納米銀溶膠，研究其制備工藝、性能和抑菌效果。以單因子對納米銀的制備進行優化。通過紫外-可見吸收光譜（UV-vis）、透射電鏡（TEM）、能量色譜（EDS）和X射線衍射（XRD）等方法對合成納米銀的特征吸收峰、形貌以及穩定性等進行分析，并考察納米銀對大腸桿菌（）和金黃色葡萄球菌（）的抑菌性能。納米銀制備適宜的優化工藝條件：在南瓜蒸煮液體積為40 mL情況下，AgNO3的初始質量濃度為1.2 g/L、pH值為13、微波加熱時間為60 s。經優化后，所制備的納米銀的UV-vis光譜在406 nm處出現強的特征吸收峰，EDS色譜進一步證實了納米銀的存在。納米銀為球形，平均粒徑為13.4 nm，粒徑小，分散性和穩定性好?？咕囼灡砻?，不同質量濃度的納米銀對和均有較強的抑制和殺滅效果，對的MIC值和MBC值分別為5 mg/L和10 mg/L，對的MIC值和MBC值分別為40 mg/L和320 mg/L。該AgNPs對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌具有抗菌能力，在食品包裝中具有較好的應用前景。

南瓜蒸煮液；納米銀；抑菌性能

納米銀（Silver Nanoparticles，AgNPs）通常指粒徑在1～100 nm的金屬銀單質，由于具有大比表面積、小尺寸和量子效應等優勢，同等濃度下其抑菌能力明顯強于銀單質，且不會產生耐藥性，具有低毒性和強抗菌活性等優點，被應用于食品包裝、水污染治理和醫療抗菌等領域[1-3]。納米銀可對食源性微生物有明顯抑制和殺滅作用，在食品包裝中加入AgNPs可有效保證食品質量，在食品保鮮方面有巨大的應用潛力[4]。目前，納米銀的制備工藝主要有物理法、化學法、生物法等，化學法制備的納米銀粒子易團聚，有些會產生有毒副產物，不環保[5]，不適合于食品包裝。如何制備出穩定性好且滿足實際應用需求、低成本、環保型的納米銀材料成為研究的一大熱點。近年來，以植物提取物為主要生物材料來合成AgNPs的生物合成法，是綠色生產納米銀最常用的方法?？芍苯?、快速地合成粒徑小、穩定性好的AgNPs，且在合成過程中不產生有毒副產物，這種綠色合成法已成為當前研究的熱點。

然而，植物材料提取物大都含有醛、糖等弱還原劑，AgNO3被醛、糖等弱還原劑還原時，反應活化能高，反應速率慢，導致生成的AgNPs容易發生互相碰撞而團聚[6]。為防止生成的AgNPs團聚，相關研究中，利用山楂[7]、姜[8]、金銀花[9]、蓮藕[10]、茜草根[11]等的提取物還原AgNO3往往采用高溫加熱回流或恒溫振蕩等方法，或以銀氨溶液代替AgNO3為銀源進行反應[12]?，F有的這些植物法制備納米銀采用的生物材料成本往往較高，加熱時間長、工藝條件苛刻且方法單一。因此，選用新穎、廉價的生物材料及其方法將成為綠色合成高效AgNPs抗菌劑和節能降耗的關鍵，對納米銀在果蔬貯藏保鮮方面的大面積推廣應用于具有重要意義。

南瓜（）又名倭瓜，是葫蘆科南瓜屬一年生草本植物，種植歷史悠久，世界各地均廣泛栽培。南瓜具有較高的營養價值，中醫認為，南瓜具有補中益氣，益心斂肺，解毒殺蟲，降糖止渴的功效。南瓜果實可溶性固形物含量較高，其中可溶性還原糖含量可達3.87 g/100 g，此外，還含有多種氨基酸、β-胡蘿卜素、果膠、礦物質和豐富的膳食纖維，通過加工可以制備各種食品[13]。在家庭中，南瓜一般通過蒸煮后食用，簡單方便，易消化，營養價值高。南瓜單獨蒸煮后，剩余的蒸煮液往往被丟棄。南瓜通過蒸煮，里面部分可溶性還原糖和酚類化合物溶于熱水中，其中的羥基和醛基起還原作用，是天然的還原劑，用于制備納米銀，簡便易得。目前，作者未見有利用南瓜蒸煮液綠色制備納米銀的相關研究和報道。

本研究直接以AgNO3為銀源代替銀氨溶液，以南瓜蒸煮液為還原劑，環保型烷基糖苷（APG）作為保護劑，采用微波輔助南瓜蒸煮液快速制備納米銀材料。利用廉價的南瓜材料結合微波加熱合成納米銀的制備工藝，成本低，清潔、無毒、環境友好，并且反應條件溫和。本研究對納米銀的制備工藝進行了單因子優化，采用紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）、掃描電鏡（TEM）等對制備的納米銀材料性能加以表征，并對納米銀溶膠的穩定性和抑菌殺菌性能進行分析，為進一步開發銀系抗菌劑及在食品包裝中的應用提供理論依據。

1 實驗

1.1 材料與儀器

細菌材料：供試菌種大腸桿菌（ATCC25922，）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923，）均由本實驗室保藏。

其他材料：南瓜為市售成熟“錦栗”（Jin Li）南瓜鮮品、NB培養基（青島海博生物技術有限公司）、瓊脂（Sigma）、烷基糖苷0810（APG，江蘇萬琪生物科技股份有限公司，中性，固含量≧50%）溶液（1 mL烷基糖苷/10 mL去離子水）、NaOH（AR）、AgNO3（AR），實驗用水均為去離子水。

主要儀器：G90F23CN3PV-BM1型微波爐，廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司；MJPS-150培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；THZ-98c搖床，上海一恒科學儀器有限公司；MK3型酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；紫外-可見光分光光度計，日本島津；500型全自動菌落計數儀，Interscience；Leica DMI4000熒光顯微鏡B，德國徠卡，激發光為536 nm，發射波長為617 nm。

1.2 方法

1.2.1 南瓜蒸煮液納米銀的制備及優化

取南瓜400 g，清洗干凈，去皮瓤，切分成小塊狀，置于500 mL燒杯中，于高壓蒸汽滅菌鍋中，在溫度121 ℃下，蒸煮1 h。冷卻后取出，紗布過濾得到蒸煮液。取20 mL稀釋至40 mL，加1 mL APG，調節pH值為11；然后加固體硝酸銀至最終質量濃度為0.8 g/L，迅速置于微波爐中，在800 W下，微波加熱40 s，取出，自然靜置1～2 h，期間用玻璃棒間歇攪拌；最后得到納米銀水溶膠。將制備的AgNPs溶膠取1 mL稀釋50倍，然后用UV-vis分光光度計進行250～500 nm波長范圍的吸收光譜掃描，確定納米銀的生成。

取5份40 mL稀釋的南瓜蒸煮液，用NaOH（質量分數為10%）水溶液將pH值調節為11，分別加入AgNO3，使其最終質量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/L。微波加熱混合液，以考察在一定體積的南瓜蒸煮液情況下，AgNO3濃度對納米銀的生成影響。在上述確定的最佳AgNO3濃度下，調節南瓜蒸煮液pH值分別為9、10、11、12、13，考察南瓜蒸煮液pH值對納米銀的生成影響。在最佳AgNO3濃度和pH值條件下，分別設置微波加熱時間為30、40、50、60、70 s，考察不同微波加熱時間對納米銀生成的影響。

取上述最佳微波加熱時間條件下的反應懸浮液，以9 000 r/min轉速離心30 min，棄去上層清液得到沉淀。用去離子水洗滌3次，收集沉淀，冷凍干燥，得到南瓜蒸煮液納米銀顆粒，備用。

1.2.2 材料的表征

采用JEOL JEM2100型透射電子顯微鏡（TEM）（日本電子株式會社）觀察納米銀顆粒形貌、粒徑情況，加速電壓為200 kV。使用IR Tracer-100傅里葉紅外光譜儀（日本島津）測定樣品的FTIR，分辨率為4 cm?1，掃描范圍為400～4 000 cm?1。采用UV2600型分光光度計（日本島津）測定納米銀溶膠的吸光度值。采用XRD-7000型XRD衍射儀（日本島津公司）分析樣品結晶度，掃描電流為30 mA，掃描電壓為40 kV，輻射源為Cu靶、Кα射線（=0.154 18 nm），2的掃描范圍為5°～80°，掃描速度為0.02（°）/s。采用光電子能譜儀分析納米銀的元素組成。在25 ℃下用電位分析儀（ZS90型Zeta電位分析儀，英國馬爾文公司）測定所制備的納米銀溶液的Zeta電位。

1.2.3 抗菌性能分析

1.2.3.1 最低抑菌濃度和最小殺菌濃度

納米銀的抗菌能力通常用最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）來衡量。采用2倍稀釋法測定納米銀的MIC和MBC值[14]。將測試菌種于NB平板上劃線，37 ℃培養過夜至可見明顯菌斑。挑取適量成熟菌落，至3 mL NB液體培養基中，在37 ℃下培養10～15 h，至OD600值約為0.6。生理鹽水OD600值調整至0.5，按照體積分數0.1%的比例加入到NB液體培養基中。在96孔板中布板，在行和行加入400 μL NB液體培養基，在、、行加入400 μL的菌液，在、、行加入400 μL的菌液。在1～11列，分別加入400 μL不同濃度的納米銀溶膠，使得每個孔中的抑菌劑濃度為前一個孔中抑菌劑濃度的1/2，在第12列中分別加入400 μL去離子水，作為對照組，其他操作與實驗組相同。將96孔板置于37 ℃，振蕩培養24 h后，吸取200 μL至96孔酶標板檢測OD600值，之后在超凈臺靜置30 min，肉眼觀察菌體渾濁情況，以不長菌的最低濃度為MIC。實驗中每個樣品做3個平行樣。

根據MIC實驗的結果，在MIC前4個梯度（5、10、20、40 mg/L），在MIC前4個梯度（80、160、320、640 mg/L）中，分別取100 μL培養液涂到NB板，在37 ℃培養18 h，拍照計數。以殺死99.9%（降低3個數量級）的供試菌株所需的最低納米銀濃度確定為MBC，實驗中每個樣品做3個平行樣。

1.2.3.2 抑菌動力學

納米銀材料的抑菌動力學關系參考相關文獻[15]，并作一定的修改。分別將、測試菌種于NB液體培養基中在37 ℃下培養10～15 h，至OD600值約為0.6，用NB液體培養基將OD600值調至0.5。配置含有最終質量濃度分別為0、5、10、20、40 mg/L納米銀材料的NB培養液各8 mL，之后分別接入OD600值為0.5的80 μL菌液，在37 ℃下恒溫震蕩培養。配置分別含有0、20、40、80、160、320 mg/L抑菌材料的NB培養液各8 mL，之后分別接入OD600值為0.5的80 μL菌液，在37 ℃下恒溫振蕩培養。同時分別做空白和對照組，空白組為NB液體培養基，對照組為NB液體培養基和菌液。每隔0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 min分別取200 μL的菌液到酶標板中，用酶標儀分別檢測OD600值，記錄數據并繪制抑菌動力學曲線。上述實驗設置3次重復。

1.2.3.3 熒光試驗

分別取1.2.3.2節中OD600值調至0.5的、2種NB液體培養液。利用NB液體培養基、納米銀溶液，分別配制含有納米銀最終質量濃度為20 mg/L的菌液、含有納米銀最終質量濃度為320 mg/L的菌液。放入37 ℃培養箱中，培養0、5、60、120 min。之后取95 μL菌液，加入5 μL碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）試劑，混合均勻后，避光染色5 min，在熒光顯微鏡下觀察細菌染色和死亡狀況。

1.2.4 數據處理

采用Origin2017軟件對南瓜蒸煮液納米銀制備工藝及結構表征數據進行制圖和分析。納米銀抑菌和殺菌效果運用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。采用Ducan檢驗分析在0.05水平上的顯著性。

2 結果與分析

2.1 南瓜蒸煮液納米銀的制備工藝優化

UV-Vis吸收光譜在400～450 nm處出現的吸收峰是納米銀形成的依據，單一的表面等離子共振帶證明合成的納米銀材料主要為球形[16]。有文獻表明，球形納米銀的共振峰位置藍移程度越強，粒徑越小，相反的，紅移則表明粒徑增加[17]。因此，采用UV-Vis吸收光譜的特征峰及對應的吸收波長大小是考察納米銀生成和優化工藝的簡便手段。所制備的納米銀溶膠的吸收光譜見圖1。

由圖1a初步實驗可知，南瓜蒸煮液和硝酸銀溶液的UV-Vis吸收光譜在400 nm附近并無吸收峰，而南瓜蒸煮液與AgNO3作用后，在400 nm附近有明顯的吸收峰。其最大吸收峰位于410.2 nm處，可初步判斷納米銀粒子形成，且為球形。吸收峰的出現是因為納米銀的表面存在自由電子運動，當這種運動與外加電磁波振蕩頻率相同時就會產生表面等離子共振吸收峰（SPR峰）。

由圖1b單因子優化試驗表明，在保持南瓜蒸煮液40 mL不變的情況下，改變硝酸銀的量，當AgNO3初始質量濃度為0.4 g/L時，在404.3 nm處出現最大峰，但納米銀質量濃度并不高；而當AgNO3的初始質量濃度為1.2 g/L時，納米銀質量濃度最大，特征峰位置紅移至406 nm處。隨著質量濃度的增加，納米銀的生成量逐漸減小，且特征峰進一步紅移，在初始質量濃度為2.0 g/L時，納米銀的特征峰位置在412.1 nm處。AgNO3質量濃度的升高使得納米銀最大吸收峰逐漸紅移，粒徑增大。這是因為AgNO3質量濃度過高導致過量未反應的Ag+聚集在AgNPs表面，并在AgNPs表面發生還原反應，新合成的納米銀富集在晶核表面，使AgNPs粒子團聚，粒徑變大。綜合考慮，AgNO3初始質量濃度選擇1.2 g/L為宜。

由圖1c可看出，在堿性條件下，隨著pH值的增大，納米銀的生成量逐漸增多，南瓜蒸煮液的pH值由11升高至12，生成納米銀的效率明顯提高，但峰形較寬；當pH值提高到13時，生成納米銀的量不再提高，但吸收峰變得尖而窄。pH值的變化對特征峰對應的波長影響不大。對南瓜蒸煮液來說，堿性環境是其還原Ag+的重要條件。隨著反應液pH值升高，參與反應的糖類及酚類化合物中的羥基官能團去質子化的能力增強，易失去H+而帶負電荷，更容易與Ag+作用生成單質Ag。因此，pH值選擇13為宜。

圖1d表明，在30 s內，由于熱效應不明顯，反應物分子有效碰撞的次數有限，因此，不能生成納米銀或很少。隨著加熱時間的延長，納米銀粒子的質量濃度逐漸增大，在60 s時，納米銀生成量最高，對應的波長最低，位于406 nm處。納米銀粒子生成量在60 s后下降，其特征峰位置紅移，粒徑變大，是因為納米銀粒子在高溫下團聚，穩定性降低，粒徑變大。因此，微波加熱時間60 s為宜。

圖1 納米銀溶膠紫外-可見吸收光譜及優化工藝

微波加熱明顯加快了納米銀粒子的形成，這是因為微波將電磁能轉化為熱能，反應體系的溫度快速升高，使AgNO3被還原的速率加快。更為重要的是，水分子的快速旋轉能破壞水分子之間的氫鍵，產生氫自由基（·H）、羥基自由基（·OH）和溶劑化電子。大量自由基和自由電子的存在使得Ag+離子的還原速率加快[18]。

2.2 南瓜蒸煮液納米銀材料的表征

2.2.1 TEM分析

通過TEM表征合成的AgNPs的形態和粒徑大小，結果如圖2所示。圖2a、b和c表明，合成的AgNPs為類球形，形態均勻。使用Image J軟件分析確定粒徑大小，結果如圖2d所示，AgNPs的粒徑范圍為3～24 nm，且具有較窄的粒徑分布，平均粒徑為13.4 nm，表明合成的AgNPs粒徑小，分散性好。該AgNPs的平均粒徑比Balciunaitiene等[19]通過苦艾提取物合成的球形AgNPs（平均粒徑50 nm）更小。烷基糖苷類表面活性劑與南瓜蒸煮液中的糖類的羥基等協同吸附和分散Ag+，保證了合成的AgNPs高分散性和小粒徑。

2.2.2 FTIR光譜分析

天然糖類含有?OH、?COOH及?C=O等官能團，這些官能團能與金屬納米粒子結合，從而增強金屬納米粒子的穩定性，阻止納米粒子聚集。FTIR光譜見圖3所示，FTIR光譜中在3 406 cm?1處為納米銀材料的O?H伸縮振動峰，表明還原劑中存在羥基，在波數為2 856、2 927 cm?1處的吸收峰為亞甲基（?CH2）、甲基（?CH3）伸縮振動產生的特征吸收峰，1 742cm?1、1 610cm?1處分別為羰基C=O和C=C振動形成的特征峰，1 381 cm?1處是C?H彎曲振動造成的，1 096cm?1處吸收峰是由C?O?C醚鍵的不對稱伸縮振動產生，該峰是糖類的特征峰[20]。由此說明，南瓜納米銀提取液中的一些可溶性糖類成分主要參與了AgNPs的形成，并作為保護基團吸附在AgNPs表面，增加了其表面極性，提高了AgNPs的穩定性和分散性，避免了AgNPs的聚集。

2.2.3 EDS分析

采用能量色譜儀對納米銀粉末中的元素進行分析，圖4為制備的納米銀材料的能譜圖（EDS）。結果表明，在3 keV時表現出納米銀材料典型的光學吸收峰[21]。這是由于AgNPs表面等離子體共振效應引起的特征吸收峰，該結果證實了制備的材料為納米銀粒子。此外，納米銀溶膠中還含有C、O等元素的存在，結合紅外結果分析，其來源主要是南瓜蒸煮液中的糖類成分，也驗證了南瓜蒸煮液成分包覆在納米銀表面。

2.2.4 XRD分析

圖5為南瓜蒸煮液納米銀的XRD圖譜。圖5中所示2角在38.48°、43.42°、64.68°和77.44°處4個特征衍射峰可分別歸屬于納米銀的（111）、（200）、（220）和（311）晶面（JCPDS No.04-0783），表明合成的納米銀晶相為面心立方結構（Face-Centered Cubic，FCC）[22]。由此，可以證明南瓜蒸煮液可以有效地合成納米銀。2角在25.18°處的寬吸收峰可能是南瓜蒸煮液中的活性物質吸附于AgNPs表面引起的。

圖2 納米銀的TEM圖（a～c)和粒徑分布圖（d）

圖3 納米銀的紅外光譜圖

圖4 納米銀的EDS圖譜

圖5 納米銀的XRD圖譜

2.2.5 穩定性

在25 ℃下，測南瓜蒸煮液納米銀的Zeta電位，結果如圖6a所示。納米銀的Zeta電位為?21.2 mV，說明納米銀材料表面吸附的糖類物質帶有負電荷。正是由于納米銀表面所帶負電荷之間的靜電排斥作用使制備的納米銀材料具有良好的穩定性，不易發生團聚。

圖6 納米銀溶膠Zeta電位(a)及靜置的穩定性(b)

將制備的納米銀溶膠，置于30 ℃下靜置30 d，然后測其吸光度的變化，考察其穩定性，結果見圖6b。在30 d內，納米銀溶膠的UV-Vis光譜的吸收峰沒有明顯變化，表明該納米銀材料在水中極穩定?？赡苁且驗槟瞎险糁笠褐械男》肿游镔|吸附在AgNPs的表面，降低了AgNPs的表面能，因此在水中不易團聚也不易沉降。

2.3 抑菌實驗

2.3.1 最低抑菌濃度和最小殺菌濃度

納米銀對和的抑制效果見表1和表2。結果表明，不同質量濃度的納米銀對和均具有明顯的抑制作用，抑制率隨著質量濃度的增加而增大。單因子方差分析和Duncan檢驗結果表明，不同質量濃度的AgNPs對和抑制性均達到顯著水平（<0.05），且隨著質量濃度的不斷增大，抑制效果越好。根據吸光度情況并結合培養液的澄清度結果顯示，該納米銀溶膠對和的MIC值分別為5 mg/L和40 mg/L，相比之下，南瓜蒸煮液制備的AgNPs比文獻[23]報道的AgNPs具有更好的抗菌活性。AgNPs的抗菌能力與其大小、形狀及表面電荷等多種因素有關[24]。AgNPs的粒徑越小，比表面積越大，更有利于與細菌的結合而改變膜的通透性，發揮抑菌作用[19]。本研究所制備的納米銀顆粒較小，可能是抑菌性好的原因之一。不過，除了粒徑本身的大小和形狀外，還由于制備的材料不同，某些材料的提取物成分具有一定的抑菌性能，在合成過程中被吸附在納米銀材料的表面，使合成的AgNPs材料的抑菌性能產生疊加效應。

表1 不同質量濃度納米銀對的抑菌情況

Tab.1 Inhibition of E.coli by AgNPs of different concentrations

注：表中數據為平均值±標準差（=3），同一列中不同小寫字母表示有顯著性差異（<0.05）；96孔板中培養液出現渾濁的用“ +”表示，澄清的則用“?”表示。

表2 不同質量濃度納米銀對的抑菌情況

Tab.2 Inhibition of S.aureus by AgNPs of different concentrations

注：表中數據為平均值±標準差（=3），同一列中不同小寫字母表示有顯著性差異（<0.05）；96孔板中培養液出現渾濁的用“ + ”表示，澄清的則用“?”表示。

表3、表4分別顯示的是銀納米粒子對和的殺菌效果?？梢钥闯?，銀納米粒子對這2株菌具有明顯的殺菌作用，且隨著銀納米粒子質量濃度的增加，殺菌效果也越來越好。根據單因素方差分析可知，2組數據差異性顯著（0.05），合成的銀納米粒子對和的殺菌效果不同，銀納米粒子對的毒害作用更強一些。和的MBC值分別為10 mg/L和320 mg/L。

2.3.2 納米銀材料的抑菌曲線

細菌培養液的吸光度可以反映培養液中細菌的增殖速度，故通過測量細菌培養液在600 nm處的吸光度值也能確定制備的納米銀對和生長的抑制作用。由圖7可見，隨著培養時間的增加，加入生理鹽水的對照組菌液的OD600值不斷增大，而加入不同質量濃度納米銀后其OD600值則發生了一定的變化。對于，當在培養液中加入不同質量濃度的納米銀后，的生長有不同程度的抑制，當納米銀的最終質量濃度為5 mg/L時，的生長被完全抑制；對于，加入最終質量濃度為20 mg/L的納米銀材料，其OD600值與對照組相比明顯變小，表明納米銀抑制了生長；將納米銀質量濃度繼續增大至40 mg/L后，其OD600值基本不發生變化，表明此質量濃度下的生長被完全抑制。由此可見，制備的納米銀對和均有較好的抑制效果。

表3 不同質量濃度納米銀對的殺菌情況

Tab.3 Sterilization of E.coli by AgNPs of different concentrations

注：表中數據為平均值±標準差（=3），同一列中不同小寫字母表示有顯著性差異（<0.05）

表4 不同質量濃度納米銀對的殺菌情況

Tab.4 Sterilization of S.aureus by AgNPs of different concentrations

注：表中數據為平均值±標準差（=3），同一列中不同小寫字母表示有顯著性差異（<0.05）。

2.3.3 熒光染色實驗

PI是一種DNA結合性染料，其激發和發射波長分別為536 nm和617 nm，產生紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細胞膜，只能染死細胞。因此，在熒光顯微鏡下觀察正常細胞不能著色，凋亡細胞（細胞膜破裂）呈紅色熒光。的熒光染色結果見圖8，的熒光染色結果見圖9。納米銀材料處理后的，隨著時間的增加。紅色熒光數量與對照組相比明顯增加。5 min后，死菌比例明顯增多，表明越來越多的細胞膜遭到破壞。細胞死亡率逐漸增加，且出現部分溶解的現象。而在未經處理的對照組中，隨著時間的增加，紅色并未出現明顯變化。也有類似的現象，經過120 min后死亡細胞明顯增多。上述實驗結果說明，制備的南瓜蒸煮液納米銀對和具備良好的殺菌效果。

圖7 抑菌動力學曲線

圖8 E.coli熒光染色

圖9 S.aureus熒光染色

制備的南瓜蒸煮液納米銀可能通過改變細菌細胞的形態和結構，使細胞失活，從而達到抗菌的作用。其可能的抗菌機制是AgNPs能夠穿通細菌細胞壁，附著在細胞膜的表面，與細胞膜表面含硫蛋白質或含磷物質產生較強的相互作用，從而改變了細胞膜的通透性，并進一步影響細胞的呼吸功能。因此，相對于，革蘭氏陰性菌由于細胞壁較薄而更易受納米銀影響，表現為抗菌性更好[25]。此外，AgNPs也可能穿過細胞膜進入細胞內，攻擊呼吸鏈，阻礙細胞代謝和細胞分裂，促進細胞凋亡。

3 結語

以南瓜蒸煮液和AgNO3為原料，APG為表面活性劑，通過微波加熱成功合成了納米銀水溶膠，進一步干燥得到了納米銀粒子。該納米銀粒子為球形，分散性和穩定性好，粒徑小。該納米銀粒子對和均有較強的抑制和殺滅效果，對的MIC值和MBC值分別為5 mg/L和10 mg/L，對的MIC值和MBC值分別為40 mg/L和320 mg/L。

目前關于納米銀制備的方法層出不窮，從環保和可持續發展的角度考慮，應大力推廣以植物提取物為代表的生物還原法制備納米銀。為了提高納米銀膠的穩定性，可以將生物還原法和微波輔助法結合使用。本研究一方面使南瓜得到了高值化利用，另一方面為AgNPs的綠色高效合成提供了新思路，所合成的AgNPs對革蘭氏陰性和陽性細菌均有良好的抗菌效果，可用于抗菌食品包裝。后續仍需對南瓜蒸煮液合成AgNPs的具體機理以及在食品包裝中的應用效果進行深度研究。

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Green Preparation of AgNPs by Pumpkin Cooking Liquid and its Antibacterial Properties

GAO Daxiang*, YANG Hetong

(Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry, Jiangsu Jurong 212400, China)

The work aims to prepare nano-silver sol by microwave heating with pumpkin cooking liquid and AgNO3as raw materials and APG as surfactant to study its preparation process, performance and antibacterial effect. The preparation of AgNPs was optimized by single factor. UV-vis, TEM, EDS, and XRD were used to analyze the characteristic absorption peaks, morphology, structure and stability of the synthesized silver nanoparticles. The antibacterial properties of AgNPs againstandwere determined. The optimum technological conditions for preparation of AgNPs were as follows: in 40 mL of pumpkin cooking liquid, AgNO3initial concentration 1.2 g/L, pH value 13, microwave heating time 60 s. After optimization, the UV-vis spectra of the prepared AgNPs showed strong characteristic absorption peaks at 406 nm, and the EDS spectrum further confirmed the existence of AgNPs. AgNPs were spherical with an average particle size of 13.4 nm, small particle size and good dispersion and stability. The antibacterial test showed that AgNPs of different concentrations had strong inhibition and killing effect onand. The MIC and MBC ofwere 5 mg/L and 10 mg/L, respectively, and the MIC and MBC ofwere 40 mg/L and 320 mg/L, respectively. The AgNPs has antibacterial ability against G-and G+bacteria and has good application prospects in food packaging.

pumpkin cooking liquid; silver nanoparticles; antibacterial property

TB484

A

1001-3563(2024)05-0081-10

10.19554/j.cnki.1001-3563.2024.05.010

2023-12-04

句容市科技項目（ZA42201）；江蘇農林職業技術學院科技項目（2021kj57）