超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蔬菜中氯酸鹽和高氯酸鹽

鄒淼，劉順鑫，馮靜，韓曉鷗

（遼寧省疾病預防控制中心，沈陽 110005）

氯酸鹽是使用含氯消毒劑消毒時產生的副產物，會阻礙甲狀腺對碘的吸收，還會破壞紅血球，引起貧血癥及高鐵性血紅蛋白血癥，導致呼吸困難[1]。高氯酸鹽化學性質穩定，溶解度高，具有一定的持久性和擴散性。高氯酸鹽由于和碘離子擁有相似的離子半徑及電荷，能夠抑制碘的吸收，影響人體甲狀腺功能，導致功能紊亂，對孕婦和嬰幼兒影響更大[2]。隨著氯酸鹽和高氯酸鹽進入環境，遷移至土壤和水體中，被水生物、植物體吸收、富集，通過食物鏈最終進入人體，威脅人類健康[3]。蔬菜是人們日常所需食物，為人體提供必需的維生素和礦物質等，其在生長及運輸的過程富集土壤、水體中的污染物，通過飲食攝入影響人體健康。目前已有報道，在大米、蔬菜、水果等產品中均有氯酸鹽和高氯酸鹽的檢出，為保障人民群眾舌尖上的安全，對蔬菜中氯酸鹽及高氯酸鹽的檢測非常必要。當前對于蔬菜中高氯酸鹽的檢測研究較多，而對于氯酸鹽和高氯酸鹽同時快速檢測較少，因此，建立高效、準確的方法同時檢測食品中氯酸鹽和高氯酸鹽殘留具有重要意義。

現有的氯酸鹽和高氯酸鹽檢測方法有離子色譜法[4-5]、離子色譜-串聯質譜法[6-7]及液相色譜-串聯質譜法[8-9]等。離子色譜法當樣品基質復雜時容易出現假陽性；離子色譜-串聯質譜法普及率較低；超高效液相色譜-串聯質譜法具有抗干擾能力強，分析速度快，靈敏度高，避免基質干擾的優點，因而得到普遍應用。

筆者以少量水稀釋分散樣品，用乙腈提取，然后用PRⅠME HLB 固相萃取柱凈化，以同位素內標法定量，建立超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蔬菜中氯酸鹽和高氯酸的快速檢測方法，為了解我國蔬菜中氯酸鹽和高氯酸鹽的殘留水平提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜串聯質譜儀：Acquity Xevo TQ型，美國沃特世公司。

臺式高速冷凍離心機：ST16R型，美國賽默飛世爾科技公司。

多用途漩渦混合器：Vortex genie2 型，美國Scientific Ⅰndustries公司。

固相萃取儀：Vac Elut SPS 24型，美國安捷倫科技有限公司。

固相萃取柱：PRⅠME HLB 型，200 mg (6 mL)，美國沃特世公司。

氯酸鹽標準溶液：1 004 μg/mL (以ClO3-計)，標準物質編號為SB05-223-2008，農業部環境保護科研檢測所。

高氯酸鹽(ClO4-)標準溶液、氯酸鹽(Cl18O3-)內標標準溶液、高氯酸鹽(Cl18O4-)內標標準溶液：質量濃度均為100 μg/mL，美國Cambridge Ⅰsotope Laboratories公司。

乙腈：色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

實驗用水為超純水，由Milli-Q純水系統制得。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

混合標準中間液：其中含有1.0 μg/mL ClO4-和2.0 μg/mL ClO3-。分別準確移取100 μL 高氯酸鹽標準溶液和20 μL氯酸鹽標準溶液至10 mL容量瓶中，用超純水定容至標線，混勻。

混合同位素內標使用液：其中含有1.0 μg/mL Cl18O4-和10 μg/mL Cl18O3-。分別準確移取100 μL高氯酸鹽內標標準溶液和1 000 μL 氯酸鹽內標標準溶液至10 mL 容量瓶中，用超純水定容至標線，混勻。

系列混合標準工作溶液：高氯酸鹽質量濃度分別為0.00、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 ng/mL，氯酸鹽質量濃度分別為0.00、2.00、4.00、10.0、20.0、40.0、100 ng/mL，同位素內標Cl18O4-和Cl18O3-質量濃度分別為5.0、50 ng/mL。分別準確移取適量的混合標準中間液至7 只10 mL 容量瓶中，每只容量瓶中加入50 μL混合同位素內標使用液，用乙酸銨-乙腈溶液(體積比為1∶2)稀釋并定容，混勻。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜儀

色譜柱：Waters Torus DEA柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司)；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μL；流動相：(A) 20 mmoL/L 乙酸銨溶液，(B)乙腈，流量為0.3 mL/min；淋洗方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions

1.3.2 質譜儀

電離方式：ESⅠ-；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h。氯酸鹽和高氯酸鹽及內標質譜參數見表2。

表2 氯酸鹽和高氯酸鹽及內標質譜參數Tab.2 Parameters of mass spectra of chlorate and perchlorate and internal standard

1.4 樣品處理

準確稱取2 g蔬菜樣品于50 mL離心管中，加入100 μL 混合同位素內標使用液，加入7.0 mL 超純水，渦旋振蕩提取5 min，再加入13.0 mL 乙腈，混勻，超聲30 min，以10 000 r/min轉速離心10 min，取上清液，待凈化。移取3.0 mL 上清液，過PRⅠME HLB固相萃取柱，棄去前1 mL初濾液，收集約1 mL續濾液，過0.22 μm再生纖維濾膜，上機測定。

1.5 樣品測定

取上述樣品溶液，在1.3 儀器工作條件下測定，以色譜峰面積內標法定量。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

氯酸鹽、高氯酸鹽及其內標物為含有強陰離子酸根的鹽類，選擇負離子模式下進行全掃描，確定ClO3-、ClO4-、Cl18O3-、Cl18O4-的母離子子離子見表2，與文獻報道的結果一致[10-12]。以上述4 種目標化合物的分子離子峰為母離子，進行子離子掃描，同時對質譜條件進行優化，選取互不干擾且響應最高的兩個離子峰作為子離子，其中響應較高的作為定量子離子，另一個作為定性子離子。

2.2 色譜條件優化

氯酸鹽及高氯酸鹽是強極性的離子化合物，常用的C18反相色譜柱很難將其完全分離，因此采用Waters Torus DEA 色譜柱，該色譜柱填料的鍵合相能對氯酸根和高氯酸根實現快速、穩定的分離，同時解決了離子交換柱不能應用有機相作為流動相的缺點。在實際測樣過程中，由于基質的不同，對目標化合物會有不同程度的抑制，等度洗脫很難滿足實驗要求，故需采用梯度洗脫方式。以20 mmoL/L乙酸銨溶液為流動相A，乙腈為流動相B，流量設定為0.3 mL/min，進行梯度洗脫，氯酸鹽、高氯酸鹽的靈敏度、峰形均能滿足分析要求，具有特異性強，假陽性少的優點。氯酸鹽及高氯酸鹽的MRM提取離子流圖見圖1。

圖1 氯酸鹽及高氯酸鹽的MRM提取離子流圖Fig.1 MRM Chromatogram of chlorate and perchlorate

2.3 樣品處理條件優化

2.3.1 提取試劑的選擇

氯酸鹽、高氯酸鹽都屬于無機陰離子，有較好的水溶性，因此，蔬菜樣品取樣后，先加入少量水稀釋分散后再加入有機溶劑提取。實驗比較了水-乙腈(體積比11∶9)、水-乙腈(體積比1∶1)、水-乙腈(體積比7∶13)、乙腈的提取效率，結果表明，用乙腈提取時，回收率不穩定波動較大，隨著水比例的增加，提取率趨于穩定，但是當乙腈比例的減少一定程度時，提取效率開始降低，結果見圖2。乙腈作為提取試劑，具有一定的組織穿透能力，對于蔬菜提取是較好的選擇。水-乙腈(體積比7∶13)的提取效率較高且穩定，因此選取水-乙腈(體積比7∶13)作為提取試劑。

2.3.2 固相萃取柱的選擇

對比了C18柱、WAX柱、PRⅠME HLB柱3種固相萃取小柱的凈化效果，結果表明，C18柱與PRiME HLB 柱的回收率無顯著性差異，而應用WAX 柱回收率相對較低，在70%左右(見圖3)。同時，PRiME HLB柱操作簡便，無需活化，節約試劑，是快速檢測的最佳選擇。為簡便操作，選取PRiME HLB固相萃取柱作為凈化柱。此外，還對過柱后的初濾液與續濾液進行了對比，發現對于氯酸鹽，其初濾液和續濾液結果存在顯著性差異，而高氯酸鹽無此差異，這與張文婷等[13]的研究結果基本一致，因此，應棄去前1 mL的初濾液，收集續濾液用于測定，以保證氯酸鹽檢測結果的正確性。

圖3 氯酸鹽和高氯酸鹽在不同固相萃取柱上的平均回收率Fig.3 Average recoveries of chlorate and perchlorate on different solid phase extraction columns

2.4 內標物的選擇

利用液相色譜-串聯質譜法測定時，目標化合物容易受到來自樣品基質的干擾，產生基質效應。常見的降低基質效應的方法有同位素內標法、基質匹配曲線法和減小進樣量等[14-15]。同位素內標有著與目標化合物相似的理化性質，能夠補償由基質效應引起的信號改變。實驗根據氯酸鹽和高氯酸鹽的性質選取內標物，氯酸鹽以Cl18O3-為內標，高氯酸鹽以為Cl18O4-內標，結果表明，以上述2種同位素為內標時，可獲得準確可靠的實驗結果。

2.5 線性范圍和檢出限

在實驗條件下分別測定系列混合標準工作溶液，分別以氯酸鹽、高氯酸鹽的質量濃度為橫坐標，以氯酸鹽、高氯酸鹽與相應同位素內標物的色譜峰面積比為縱坐標，繪制標準工作曲線，以3倍信噪比對應的氯酸鹽、高氯酸鹽質量濃度作為方法檢出限，以10倍信噪比對應的氯酸鹽、高氯酸鹽質量濃度作為方法定量限，氯酸鹽、高氯酸鹽的質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數和檢出限、定量限見表3。

表3 氯酸鹽、高氯酸鹽的線性關系、相關系數、檢出限、定量限Tab.3 Linear relationship， correlation coefficients， detection limits， and limit of quantitation of chlorate and perchlorate

2.6 樣品加標回收試驗

選取3 組蔬菜陰性樣品，每組6 份，分別加入混合標準中間液及混合同位素內標使用液，混勻，靜置，使其充分混合，然后利用該實驗方法進行樣品處理，上機測定，測定結果見表4。由表4 可知，氯酸鹽、高氯酸鹽的平均回收率為88.9%～97.1%，相對標準偏差為2.9%～7.4%(n=6)，回收率和精密度均滿足實際樣品測定的要求。

表4 樣品加標回收試驗結果Tab.4 Recovery results of spiked samples

3 結語

采用Waters Torus DEA 色譜柱，少量水稀釋分散，乙腈提取，PRⅠME HLB固相萃取柱凈化，結合同位素內標法進行定量，建立超高效液相色譜-串聯質譜法測定蔬菜中氯酸鹽和高氯酸鹽。與其他實驗方法相比，選用合適比例的水-乙腈保證提取效率，采用PRⅠME HLB 固相萃取柱簡化凈化步驟，應用同位素內標降低基質效應，使得蔬菜中氯酸鹽及高氯酸鹽的檢測更加準確，便捷，高效，具有良好的精密度和回收率，適用于蔬菜中氯酸鹽及高氯酸的大批量快速檢測。