紫茉莉種子中對草地貪夜蛾的殺蟲活性成分及殺蟲機制

詹 麗, 李敬丹, 付 璇, 梁宗鎖, 梁 倩

(1.西南林業大學林學院,云南 昆明 650224; 2.浙江理工大學紹興生物醫藥研究院,浙江 紹興 312000)

草地貪夜蛾(SpodopterafrugiperdaJ.E.Smith)屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾屬(Spodoptera)昆蟲,主要寄主為玉米[1],是一種重大農業害蟲[2]。2019年,中國多個省份發生草地貪夜蛾入侵,對玉米和甘蔗危害面積超過5×106hm2[3],給農業生產帶來了巨大威脅。近年來,虱螨脲、除蟲脲、乙基多殺菌素和溴氰蟲酰胺等多種殺蟲劑在防治草地貪夜蛾方面發揮了重要作用[4]。但是隨著化學農藥的使用,害蟲的抗藥性及環境問題日益突出,據報道草地貪夜蛾已對虱螨脲、氟胺氰菊酯和毒死蜱等41種傳統及新型殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性[5-6]。在尼日利亞的玉米田里,從玉米播種到收獲期間,噴施11種不同劑量的藥劑,玉米采收后,測定20 cm土層深度的土壤樣品中農藥殘留,其中氯菊酯和毒死蜱等殺蟲劑對土壤中的生物和其他非靶標物種會產生有害影響[7]。因此,篩選或研發高效、安全的植物源殺蟲劑是保障農業綠色生產可持續發展的重要措施。植物源殺蟲劑通過不同的作用機制影響害蟲的消化、神經、內分泌和呼吸系統,分子水平上一般通過作用于昆蟲細胞信號通路中的某些重要靶點,干擾神經系統的信號傳遞(如神經遞質的合成、儲存、釋放、結合和再攝取等)或阻斷生物代謝途徑而發揮殺蟲活性[8]。利用植物殺蟲活性成分制成的殺蟲劑,具有無污染、作用方式多樣、易降解、低毒且不易產生耐藥性等特點[9],是未來害蟲防治中很有潛力的化學農藥替代品。

紫茉莉(MirabilisjalapaL.)原產于南美,具有耐貧瘠、生長迅速、適應能力和繁殖能力強等生物特征,中國很多地區都有栽培[10]。研究發現10 mg/ml紫茉莉全草乙醇提取物對二斑葉螨(Tetranychusurticae)雌成螨24 h時觸殺活性的校正死亡率為76.5%,第5 d對二斑葉螨卵的觸殺活性的校正死亡率為33.7%[10]。紫茉莉葉與莖提取物對4齡尖音庫蚊(Culexpipiens)幼蟲觸殺活性的LC50分別為6.84 mg/ml和3.98 mg/ml,對成蟲熏蒸活性的LC50分別是0.14 mg/ml和0.27 mg/ml[11]。紫茉莉葉提取物濃度為0.8 g/ml時與白僵菌(Beauveriabassiana)混合使用,會使甘藍薄翅螟(Crocidolomiapavonana)化蛹時間延長、蛹質量減輕、化蛹率降低及死亡率增加[12]。紫茉莉葉提取物質量濃度為0.8 g/ml時與綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)混配處理甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)可破壞甜菜夜蛾的免疫系統,48 h甜菜夜蛾的死亡率達到76%[13]。但目前針對紫茉莉種子中對草地貪夜蛾的殺蟲活性成分及殺蟲機制的研究未見報道。

本試驗基于前期紫茉莉種子各萃取物對草地貪夜蛾的觸殺、胃毒和拒食活性篩選,發現石油醚萃取物的觸殺活性最好[14]。因此以觸殺活性為依據進行硅膠柱層析分離和GC-MS分析,明確其活性成分,并測定活性成分對草地貪夜蛾體內3種酶活性的影響,為紫茉莉植物資源的開發利用及新型植物源殺蟲劑的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物樣品 紫茉莉種子于2020年9月購自云南省昆明市螺螄灣中藥材市場,種子陰干粉碎備用。

1.1.2 供試昆蟲 草地貪夜蛾蟲卵由河南省濟源白云實業有限公司提供,在培養箱培養,溫度24～26 ℃,相對濕度70%～80%,光/暗周期16 h/8 h,初孵幼蟲用新鮮玉米葉喂養,選取健康、生長發育狀況相同的3齡幼蟲作為試驗幼蟲。

1.1.3 試驗試劑 供試試劑和酶試劑盒:石油醚、乙酸乙酯、甲醇和乙醇購自云南利妍科技有限公司;三氯甲烷從西南林業大學易制毒管理處領取;吐溫80購自天津風船化學試劑科技有限公司;十三烷(≥98%)購自上海麥克林生化科技股份有限公司;亞油酸乙酯(≥98%)、油酸乙酯(≥95%)購自上海源葉生物科技有限公司;AChE試劑盒、CarE試劑盒和Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒購自蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫茉莉種子石油醚萃取物硅膠柱層析分離 用薄層色譜確定硅膠柱層析分離的洗脫體系為:石油醚、石油醚∶三氯甲烷=50∶1(體積比)、石油醚∶三氯甲烷=1∶1(體積比)、三氯甲烷、三氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶1(體積比)、乙酸乙酯、乙酸乙酯∶甲醇=20∶1(體積比)、乙酸乙酯∶甲醇=1∶1(體積比)、甲醇。

1.2.2 GC-MS檢測條件 氣相色譜條件:色譜柱為HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序,100 ℃保持2 min, 以4 ℃/min升至250 ℃,保持10 min;載氣(He)流速1.2 ml/min,進樣口溫度250 ℃,柱前壓100 kPa,進樣量0.2 ml,分流比100∶1。

質譜條件:電離方式(EI)離子源,電子能量70 eV,接口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃。電子倍增器電壓1 894 V。采用wiley7n.l標準譜庫檢索定性。通過面積歸一化法計算各化合物的相對含量。

1.2.3 20個餾分及主要化合物對草地貪夜蛾的殺蟲活性 參照宋潔蕾等[15]的方法,測定餾分及化合物的殺蟲活性,略有改動。20個餾分樣品用0.5%吐溫80水溶液分別配成10.00 mg/ml的溶液。餾分2的主要化合物用0.5%吐溫80水溶液配成不同濃度梯度的溶液。將草地貪夜蛾3齡幼蟲分別在不同餾分及主要化合物的溶液中浸漬5 s,用毛筆挑出放入飼養盒,每盒1頭,用新鮮玉米葉片飼養,每個處理幼蟲10頭,重復5次。第1 d、3 d、5 d、7 d觀察草地貪夜蛾并記錄死亡與存活數量。根據公式(1)和(2)計算死亡率以及校正死亡率。

(1)

(2)

1.2.4 酶活性的測定方法

1.2.4.1 供試幼蟲處理及酶液制備 將亞油酸乙酯配制成10.00 mg/ml、5.00 mg/ml、2.50 mg/ml、1.25 mg/ml和0.63 mg/ml不同質量濃度的溶液,采用浸蟲法處理草地貪夜蛾3齡幼蟲,浸漬5 s,每個質量濃度處理10頭,重復5次,0.5%吐溫80水溶液處理作為對照。于處理后第7 d挑取草地貪夜蛾幼蟲,稱取0.1 g,按酶試劑盒說明書制備待測樣本。

1.2.4.2AChE、CarE和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的測定 具體操作分別參照AChE、CarE和Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒說明書。根據公式(3)、(4)和(5)計算AChE、CarE和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

=191.2×△A/W

(3)

(4)

(5)

式中: △A為讀取測定管與對照管的吸光值之差;V為加入提取液的體積(1 ml);V1、V3和V5為加入樣本的體積,分別為0.06 ml、0.04 ml和0.20 ml;V2和V4為反應體系總體積,分別為0.78 ml和0.68 ml;ε為TNB摩爾消光系數[13.6×103L/(mol·cm)];d為比色皿光徑(1 cm);W為樣本質量(g);T1,T2,T3為反應時間,分別為5 min、3 min和20 min;D為稀釋倍數,若未稀釋則數值為1。

1.3 數據分析

數據采用Microsoft Excel進行整理,用SPSS 23.0軟件進行分析,計算草地貪夜蛾的半數致死濃度LC50、95%置信區間、卡方、酶活性的平均值和標準差,用Origin軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 紫茉莉種子20個餾分對草地貪夜蛾的殺蟲活性

由表1可知, 20個餾分用10.00 mg/ml質量濃度處理草地貪夜蛾后,餾分2第1 d、3 d、5 d和 7 d的校正死亡率(%)均顯著高于其他餾分(P<0.05),表明其具有較強的殺蟲活性。

2.2 餾分2的GC-MS分析及化學成分的殺蟲活性

2.2.1 餾分2的化學成分 由表2可知,紫茉莉種子餾分2的主要成分為十三烷(9.59%)、亞油酸乙酯(51.14%)和油酸乙酯(34.26%),總含量為94.99%。

表2 餾分2的主要化學成分

2.2.2 餾分2的主要化學成分對草地貪夜蛾的殺蟲活性 由表3可知,亞油酸乙酯在第1 d、3 d、5 d、7 d的半致死質量濃度(LC50)均最小,殺蟲效果最好。其次為十三烷和油酸乙酯。綜合比較,亞油酸乙酯殺蟲效果最明顯。

2.3 亞油酸乙酯對草地貪夜蛾AChE、CarE和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

2.3.1 亞油酸乙酯對AChE活性的影響 由圖1可知,不同質量濃度亞油酸乙酯處理草地貪夜蛾5 s后,飼養到第7 d,與對照相比,AChE活性呈現先抑制后激活再抑制的趨勢。與對照相比,0.63 mg/ml和1.25 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾AChE活性顯著降低(P<0.05)。0.63 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾AChE活性是對照的0.79倍,1.25 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾AChE活性是對照的0.91倍。與對照相比,2.50 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾AChE活性顯著提高(P<0.05),活性是對照的1.18倍。與對照相比,5.00 mg/ml和10.00 mg/ml亞油酸乙酯處理,AChE活性顯著降低(P<0.05)。5.00 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾AChE活性是對照的0.96倍。10.00 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾AChE活性是對照的0.69倍。

2.3.2 亞油酸乙酯對CarE活性影響 由圖2可知,不同質量濃度亞油酸乙酯處理草地貪夜蛾5 s后,飼養到第7 d,與對照相比,CarE活性呈現先抑制后激活的趨勢。與對照相比,0.63 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾CarE活性顯著降低(P<0.05),是對照的0.64倍。1.25 mg/ml、2.50 mg/ml和10.00 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾CarE活性顯著提高(P<0.05)。1.25mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾CarE活性是對照的1.31;2.50 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾CarE活性是對照的1.50倍;5.00 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾CarE活性是對照的1.80倍;10.00 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾CarE活性是對照的1.26倍。

2.3.3 亞油酸乙酯對Ca2+-Mg2+-ATP酶活性影響 由圖3可知,不同質量濃度亞油酸乙酯處理草地貪夜蛾5 s后,飼養到第7 d,與對照相比,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈現先激活后抑制的趨勢。0.63 mg/ml亞油酸乙酯處理,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與對照相比無顯著差異(P>0.05)。與對照相比,1.25 mg/ml和2.50 mg/ml亞油酸乙酯處理,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著提高(P<0.05)。1.25 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾Ca2+-Mg2+-ATP酶活性是對照的2.03倍;2.50 mg/ml亞油酸乙酯處理,草地貪夜蛾Ca2+-Mg2+-ATP酶活性是對照的1.49倍。與對照相比,10.00 mg/ml亞油酸乙酯處理,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著降低(P<0.05),活性是對照的0.65倍。

表3 餾分2的化學成分對草地貪夜蛾的殺蟲活性

圖中不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。

圖中不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。

圖中不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。

3 討 論

對紫茉莉種子石油醚萃取物進行柱層析分離共得到20個餾分,其中餾分2的觸殺活性最好,第1 d、3 d、5 d和7 d草地貪夜蛾校正死亡率分別為74.00%、80.00%、82.00%和82.00%,與其他餾分差異顯著(P<0.05)。經GC-MS分析,餾分2的主要化學成分為十三烷(9.59%)、亞油酸乙酯(51.14%)和油酸乙酯(34.26%)。亞油酸乙酯觸殺活性最好,第1 d、3 d、5 d和7 d的LC50分別為8.62 mg/ml、7.26 mg/ml、6.23 mg/ml和5.70 mg/ml。文獻報道萬壽菊(Tageteserecta)、曼陀羅(Dathurametel)和鴨嘴花(Adathodavassica)乙酸乙酯粗提物對草地貪夜蛾3齡幼蟲第1 d的LC50分別為246.4 mg/ml、420.8 mg/ml和1 253.1 mg/ml,第3 d的LC50分別為186.7 mg/ml、295.5 mg/ml和1 118.2 mg/ml[16]。毛脈樹胡椒(Piperhispidinervum)揮發油對草地貪夜蛾3齡幼蟲96 h的LD50為每頭277.91 μg[17](文獻中的點滴量為1 μl)。姜(Zingiberofficinale)根莖正己烷提取物及分離得到的10-姜烯酚和8-姜烯酚24 h時對草地貪夜蛾2齡幼蟲的LD50分別為每頭18.98 μg、8.55 μg和7.68 μg[18](文獻中的點滴量為1 μl)。紫茉莉種子石油醚萃取物第7 d對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50為6.07 mg/ml[14]。麻風樹(Jatrophacurcas)種子油經柱層析分離,富含佛波酯的餾分對草地貪夜蛾24 h的LC50為0.83 mg/ml[19]?？梢钥闯?亞油酸乙酯對草地貪夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性要優于萬壽菊、曼陀羅、鴨嘴花乙酸乙酯粗提物以及毛脈樹胡椒揮發油、姜根莖正己烷提取物、10-姜烯酚、紫茉莉種子石油醚萃取物,但是不及8-姜烯酚和麻風樹種子油柱層析富含佛波酯餾分的活性。

亞油酸乙酯對其他害蟲也具有殺蟲活性及引誘活性。飛燕草(Consolidaajacis)甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物對小菜蛾均具有觸殺活性,乙酸乙酯萃取物觸殺活性最強,經GC-MS分析,4個主要成分中亞油酸乙酯對小菜蛾的觸殺活性最好,72 h的LC50為0.26 mg/ml[20]。梔子(Gardeniajasminoides)揮發油對煙粉虱(Bemisiatabaci)和二斑葉螨(Trialeurodesvaporariorum)若蟲具有殺蟲活性。經過GC-MS分析,其中5種主要化合物中,亞油酸乙酯對煙粉虱若蟲的觸殺活性最好,對二斑葉螨若蟲的觸殺活性僅次于殺蟲活性最好的角鯊烯[21]。加拿大一枝黃花(Solidagocanadensis)地上部分石油醚萃取物對方形環棱螺(Bellamyaquadrata)24 h和48 h的LC50均優于乙酸乙酯和正丁醇萃取物,分別為1.10 mg/ml和0.23 mg/ml,石油醚萃取物經GC-MS分析,亞油酸乙酯含量最高(12.18%),認為可能是亞油酸乙酯對方形環棱螺具有殺蟲活性[22]。香菜(Coriandrumsativum)等8種植物乙醇粗提物對黑肩綠盲蝽(Cyrtorhinuslividipennis)雌蟲引誘率最高,達46.67%,經GC-MS分析,亞油酸乙酯含量最高,為13.52%,認為亞油酸乙酯可能對黑肩綠盲蝽具有引誘活性[23]。

廣藿香酮(Pogostone)對斜紋夜蛾(Spodopteralitura)幼蟲體內的AChE活性變化表現為隨著處理質量濃度的增高呈現先抑制后激活再抑制的趨勢[24]。敵敵畏、甲氰菊酯和氯氰菊酯對中華蜜蜂(Apiscerana)體內的AChE活性呈現先抑制后激活再抑制的趨勢[25]。本試驗不同質量濃度亞油酸乙酯處理草地貪夜蛾后,第7 d時,AChE活性的變化也表現為先抑制后激活再抑制的趨勢。造成這種趨勢的原因可能是亞油酸乙酯與草地貪夜蛾體內AChE結合,使AChE磷?；?AChE活性被抑制[26]。

隨質量濃度的提高,廣藿香酮對斜紋夜蛾幼蟲中腸CarE的活性變化表現為先抑制后激活的作用[24],甲維鹽對草地貪夜蛾體內CarE活性表現為先抑制后激活作用[27],異菌脲對意大利蜜蜂(Apismellifera)體內CarE活性表現為先抑制后激活作用[28]。本試驗不同質量濃度亞油酸乙酯處理草地貪夜蛾后,第7 d,其體內CarE活性隨著亞油酸乙酯質量濃度的升高表現為先抑制后激活作用。低質量濃度亞油酸乙酯處理草地貪夜蛾時,由于供試害蟲中毒后體內正常的代謝受到影響,間接影響了羧酸酯酶的活性[29],后又呈現激活趨勢,可能是由于外源性有毒物質刺激了昆蟲體內的應激免疫,從而誘導CarE活性的增加,加速了對外源性物質的解毒代謝[30]。

隨質量濃度的提高,瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)根石油醚提取物對桃蚜(Myzuspersicae)體內Ca2+-Mg2+-ATP酶活性表現為先激活后抑制趨勢[31],丁香酚對枸杞蚜蟲(Aphissp.)和枸杞木虱(Paratriozasinica)成蟲Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈現低劑量激活高劑量抑制趨勢。香茅(Cymbopogoncitratus)油對枸杞木虱成蟲Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈現低劑量激活高劑量抑制作用。本試驗不同質量濃度亞油酸乙酯處理草地貪夜蛾后,第7 d,其體內Ca2+-Mg2+-ATP酶活性隨著亞油酸乙酯質量濃度的升高表現為先激活后抑制的趨勢。關于低質量濃度處理下Ca2+-Mg2+-ATP酶活性被激活,可能與昆蟲中毒初期表現過度興奮的癥狀有關[32]。高質量濃度處理下Ca2+-Mg2+-ATP酶活性被抑制,可能因為Ca2+和Mg2+離子的跨膜平衡受到破壞,影響離子通道的開放或關閉,發生電位異常,害蟲神經系統功能紊亂[33]。

4 結 論

本研究采用硅膠柱層析法分離紫茉莉種子石油醚萃取物,共得20個餾分,殺蟲試驗測試結果表明,餾分2對草地貪夜蛾的殺蟲活性最好,經GC-MS分析,主要化學成分為十三烷(9.59%)、亞油酸乙酯(51.14%)和油酸乙酯(34.26%)。處理后第7 d,這3種主要化學成分對草地貪夜蛾的LC50分別為15.06 mg/ml、5.70 mg/ml和18.42 mg/ml,亞油酸乙酯的殺蟲活性最高。隨亞油酸乙酯質量濃度的增加,草地貪夜蛾3齡幼蟲體內AChE活性呈現先抑制后激活再抑制的趨勢,CarE活性呈現先抑制后激活的趨勢,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈現先激活后抑制的趨勢。