結球甘藍CBF家族特征分析及低溫誘導基因BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3表達分析

張 偉, 余方偉, 李建斌, 于 利, 王神云

(江蘇省農業科學院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇 南京 210014)

結球甘藍(Brassicaoleraceavar.capitataL.),是十字花科蕓薹屬蔬菜,可形成葉球,含有豐富的維生素C和礦物質,營養極為豐富。甘藍常被烹食或者生食,是追求健康飲食人群喜愛的食物之一;由于其具有較強的適應性和抗逆性,全國各地均有種植,年種植面積約9×105hm2[1],是中國重要的保障供應蔬菜之一。

低溫是影響作物產量和營養品質的一種非生物脅迫[2]。結球甘藍喜溫和冷涼氣候,種子發芽適宜溫度為20～25 ℃,結球期適宜溫度為15～20 ℃。結球甘藍的適應能力較強,但過低的溫度仍然會減緩其生長速度,降低營養品質;特別是在1～4 ℃低溫條件下,植株很容易通過春化作用發生“先期抽薹”[3];0 ℃以下的凍害溫度會導致幼苗或葉球凍傷或是直接凍死,嚴重影響產量[4-5]。結球甘藍植株不同生長時期的耐寒性也不同,具有6～8片葉的幼苗其耐寒性比較強,能忍耐-5～-2 ℃的低溫凍害;經過低溫馴化的幼苗,能忍耐短期-12～-8 ℃的低溫嚴寒;成熟期的葉球耐寒性雖不如幼苗時期,但早熟品種的葉球能忍耐短期-5～-3 ℃的低溫,中、晚熟品種的葉球能忍耐短期-8～-5 ℃的低溫[6]。

低溫信號途徑是依賴于CBF(C-repeat binding factor)轉錄因子的ICE1-CBF-COR信號轉導途徑。在低溫脅迫下,ICE1轉錄因子可直接與3個低溫響應基因(CBF1、CBF2、CBF3)基因啟動子區域結合[7],被激活的CBF轉錄因子與冷誘導基因(COR)啟動子區域CRT/DRE元件結合,誘導COR基因的轉錄,使其迅速響應低溫脅迫,從而提高植株的耐冷性[8]。AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因在擬南芥4號染色體上串聯排列,不依賴ABA信號轉導,受低溫脅迫誘導表達,在響應低溫脅迫的基因調控中發揮重要作用[9-10]。而AtCBF4與AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3成員的基因功能不同,依賴ABA信號轉導,不受低溫脅迫誘導表達,但在抗旱過程中發揮一定的作用[11]。有研究結果表明過量表達AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因能大幅提高擬南芥植株的抗凍性,其下游大量的COR基因被誘導表達[9-10]。與野生型擬南芥相比,cbf1/cbf2/cbf3 3突變體在冷馴化后表現出強烈的凍敏感表型,且AtCBF基因的突變影響了擬南芥全轉錄組中10%～20%的COR基因表達[12-13]。此外,在油菜、番茄、大麥、玉米及水稻等作物中也發現CBF基因具有冷誘導表達特征[14-18]。單子葉植物和雙子葉植物的CBF基因均與低溫脅迫響應密切相關,說明植物中CBF基因在低溫信號途徑中發揮的作用相對保守。

本研究為了探索與擬南芥同為十字花科的結球甘藍作物中CBF基因是否也存在冷誘導特性,對結球甘藍全基因組中CBF家族成員進行鑒定,并分析其編碼的蛋白特征、基因結構、系統發育、不同器官/組織表達量以及2 ℃低溫脅迫下的基因表達模式等,挑選出候選低溫誘導基因,為進一步開展BoCBF基因響應低溫脅迫的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 結球甘藍CBF家族成員鑒定

擬南芥AtCBF蛋白氨基酸序列(AtCBF1-AT4G25490、AtCBF2-AT4G25470、AtCBF3-AT4G25480、AtCBF4-AT5G51990)從NCBI數據庫獲取。結球甘藍和大白菜全基因組序列分別參考結球甘藍923[19]和大白菜Chiifu-401-42 V3.0[20]基因組。將AtCBF蛋白氨基酸序列用BLASTP分別搜索結球甘藍和大白菜全基因組序列,獲取候選結球甘藍BoCBF和大白菜BrCBF蛋白氨基酸序列。利用Pfam 35.0和SMART數據庫分析候選BoCBF和BrCBF蛋白的保守結構域,剔除不含AP2(PF00847)結構域的候選蛋白質,確定BoCBF和BrCBF家族成員。

1.2 BoCBF蛋白理化特征及系統發育分析

采用ProtParam工具分析BoCBF蛋白的理化特征,包括氨基酸序列長度、相對分子質量、理論等電點、不穩定指數、脂肪族氨基酸指數和總平均親水性等特征。采用MEGA v7.0.26軟件對BoCBF、BrCBF和AtCBF蛋白氨基酸序列進行聚類分析,選擇最大似然法(Bootstrap值設定為1 000)繪制系統發育樹。

1.3 BoCBF基因結構、物理位置及亞細胞定位預測分析

在結球甘藍923全基因組數據庫中分別獲取BoCBF基因的gDNA和CDS序列,利用在線工具GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/)繪制外顯子-內含子結構圖。根據BoCBF基因的物理位置,使用MapChart v2.3軟件繪制BoCBF基因染色體位置圖。采用在線軟件BaCelLo和Plant-mPLoc[21-22]對BoCBF蛋白的亞細胞定位進行預測。

1.4 CBF基因進化約束值分析和基因組加倍事件發生時間估計

通過DnaSP v6軟件[23]計算結球甘藍和擬南芥CBF基因之間的進化約束值(非同義替換率Ka/同義替換率Ks)。非同義替換率計算公式為非同義替換的SNP數/非同義替換位點數,同義替換率計算公式為同義替換的SNP數/同義替換位點數。利用同義替換率來估算結球甘藍和擬南芥之間全基因組加倍事件發生的時間。估算公式為加倍事件發生時間(T)=Ks/2λ[擬南芥每年每個同義替換位點發生替換的速率(λ)為1.5×10-8][24]。

1.5 不同器官/組織及低溫脅迫下BoCBF基因表達量分析

選取耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9為試驗材料,將其種子播種在32孔穴盤中,放進人工氣候室中正常管理,環境條件設置:白天溫度為25 ℃,光照時間14 h,夜晚溫度為18 ℃。待結球甘藍長至五葉一心,轉移至春化室進行2 ℃低溫脅迫,處理不同時間(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h)后進行取樣,將葉片放入錫箔紙并立即于液氮中冷凍,在-80 ℃冰箱中保存備用。選擇低溫脅迫處理0 h、6 h、24 h的葉片樣品送廣州基奧迪生物科技有限公司進行轉錄組測序。此外,從NCBI的GEO數據庫下載了結球甘藍02-12正常生長條件下7個不同器官/組織(芽、愈傷組織、花、葉、根、角果和莖)的轉錄組數據(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE42891,GSE42891數據集)用于BoCBF基因不同器官/組織的表達量分析。以結球甘藍923基因組作為轉錄組分析的參考基因組,以FPKM值來表示結球甘藍BoCBF基因在不同器官/組織及低溫脅迫下的表達量,利用Excel軟件計算平均值和標準差,繪制柱形圖。

1.6 BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因相對表達水平分析

將上述保存的低溫處理0 h、3 h、6 h、12 h、24 h的葉片樣品分別提取植物總RNA,并合成第一鏈cDNA。參照結球甘藍923基因組[19]序列,利用Beacon Designer 7.7軟件分別設計BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF3基因和內參基因BoActin2的特異引物序列(表1)。利用SYBR Green染料法在羅氏熒光定量PCR儀器上進行PCR反應,試驗采取3次技術重復,通過2-△△Ct計算方法計算基因的相對表達水平和標準差[25]。

表1 實時熒光定量PCR引物

2 結果與分析

2.1 結球甘藍CBF家族成員鑒定、理化特征及系統發育分析

通過對結球甘藍和大白菜全基因組數據庫BLASTP搜索以及AP2保守結構域的在線驗證,分別鑒定到7個BoCBF蛋白和6個BrCBF蛋白(表2)。BoCBF蛋白的氨基酸序列長度為203～283 aa,相對分子質量為2.25×104～3.11×104。BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF2c、BoCBF3、BoCBF4a、BoCBF4b理論等電點為4.58～6.14,為弱酸性蛋白質;BoCBF2b理論等電點為7.63,為弱堿性蛋白質。蛋白質的不穩定指數為45.78～68.32,均超過臨界值40。此外,BoCBF蛋白的脂肪族氨基酸指數為56.78～73.20,總平均親水性指數為-0.598～-0.314,均為親水性蛋白質。

表2 結球甘藍CBF家族成員理化特征

采用MEGA v7.0.26軟件對結球甘藍、大白菜和擬南芥17個CBF蛋白氨基酸序列構建系統發育樹(圖1)。CBF蛋白被分成2個亞組,亞組Ⅰ包含12個CBF蛋白,亞組Ⅱ包含5個CBF蛋白。其中亞組Ⅰ包括5個結球甘藍CBF蛋白(BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF2b、BoCBF2c和BoCBF3),4個大白菜CBF蛋白和3個擬南芥CBF蛋白。亞組Ⅱ包括2個結球甘藍CBF蛋白(BoCBF4a和BoCBF4b),2個大白菜CBF蛋白和1個擬南芥CBF蛋白。相比擬南芥CBF家族成員,結球甘藍和大白菜CBF家族成員之間的親緣關系更近。

圖1 結球甘藍、大白菜和擬南芥CBF蛋白系統發育分析

2.2 BoCBF基因結構、物理位置及其編碼蛋白質的亞細胞定位預測分析

BoCBF2b基因包含3個外顯子和2個內含子,BoCBF2c基因包含2個外顯子和1個內含子,BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF3、BoCBF4a和BoCBF4b均只有1個外顯子,沒有內含子(圖2)。此外,本研究還分析了7個BoCBF基因在結球甘藍染色體上的物理位置分布,其中BoCBF2b和BoCBF2c串聯分布在3號染色體上,BoCBF2a位于7號染色體上,BoCBF1和BoCBF3串聯分布在8號染色體上,BoCBF4a和BoCBF4b串聯分布在9號染色體上(圖3)。

圖2 BoCBF基因外顯子-內含子結構圖

圖3 BoCBF基因在染色體上的物理位置分布

為了預測BoCBF蛋白亞細胞定位信息,分別利用BaCelLo和Plant-mPLoc工具在線進行預測(表3)。結果表明,結球甘藍BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF2b、BoCBF2c、BoCBF3和BoCBF4a蛋白均被預測定位于細胞核中,BoCBF4b被預測可能定位在細胞質或細胞核中。

表3 BoCBF蛋白亞細胞定位預測

2.3 CBF基因進化約束值分析和基因組加倍事件發生時間估計

除AtCBF4與BoCBF4b同源基因對外,其余6個CBF直系同源基因對的進化約束值(Ka/Ks)均遠小于1(0.156～0.294),表明進化中CBF基因以純化選擇作用為主(表4)。在結球甘藍和擬南芥的直系同源基因對中,同義替換率為0.490～0.815。以擬南芥每年每個同義替換位點發生替換的速率(λ)為參考,利用結球甘藍和擬南芥的直系同源基因對的同義替換率(Ks)估算,結球甘藍和擬南芥之間全基因組加倍事件發生的時間大致發生在1.63×107～2.72×107年前。由表4可知,相比同源基因AtCBF2,BoCBF2a、BoCBF2b、BoCBF2c基因可能發生了全基因組三倍化事件(WGT),且它們的發生時間為1.63×107～1.97×107年前,這與蕓薹族物種與擬南芥進行分化后經歷了一次額外的全基因組三倍化事件的時間(1.30×107～1.70×107年前)相符合[26]。

表4 結球甘藍和擬南芥CBF基因進化約束值及基因組加倍事件發生時間預測

2.4 結球甘藍不同器官/組織及低溫脅迫下BoCBF基因表達量分析

本研究分析了5個BoCBF基因在結球甘藍7個不同器官/組織中的表達量(圖4)。其中BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因在甘藍多個器官/組織中基本不表達(FPKM<1),僅在愈傷組織、根和莖中有較低的表達量。BoCBF4a基因僅在愈傷組織、根和莖中有中等表達量,BoCBF4b基因在莖中表達量中等,在根中表達量較高。

圖4 轉錄組測序分析結球甘藍02-12不同器官/組織中BoCBF基因表達量

本研究還分析了5個BoCBF基因在低溫脅迫下的表達模式(圖5),耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9中BoCBF2b和BoCBF2c基因的表達量均為0。在未進行低溫處理時(0 h),BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因在耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9中的表達量幾乎為0,BoCBF4a和BoCBF4b基因表達量較低。低溫脅迫處理0～6 h,BoCBF1和BoCBF2a基因迅速響應,表達量上升,其中不耐寒結球甘藍D9中BoCBF2a基因表達量急劇升高;低溫脅迫6 h后至24 h,耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9中BoCBF1和BoCBF2a基因的表達量急劇下降。此外,低溫脅迫0～24 h,耐寒結球甘藍923中BoCBF4a和BoCBF4b基因表達量基本沒有變化,說明BoCBF4a和BoCBF4b基因不受低溫誘導表達。不耐寒結球甘藍D9中BoCBF4a和BoCBF4b基因表達量在低溫脅迫0～6 h下降,在低溫脅迫6 h后至24 h表達量急劇上升。

根據前期擬南芥響應低溫信號途徑的研究結果[27],可知擬南芥中響應低溫脅迫的AtCBF基因家族成員主要為AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3,且基因快速響應的時間為低溫脅迫0～3 h。結合圖5的分析結果,本研究選取BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因,通過實時熒光定量PCR分析兩個不同耐寒性結球甘藍品種在低溫脅迫0 h、3 h、6 h、12 h和24 h后這3個基因的相對表達量。如圖6所示,不耐寒結球甘藍D9中BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因的相對表達量在低溫脅迫3 h達到最大值;耐寒結球甘藍923中BoCBF2a和BoCBF3基因的相對表達量在低溫脅迫3 h達到最大值,BoCBF1基因相對表達量在低溫脅迫6 h達到最大。BoCBF1、BoCBF2和BoCBF3基因的相對表達量達到峰值后急劇下降,在24 h降至最低。

圖5 轉錄組測序分析BoCBF基因在2 ℃低溫脅迫下的表達量

圖6 實時熒光定量PCR分析2 ℃低溫脅迫下BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因相對表達水平

3 討 論

低溫對結球甘藍栽培有較大影響,產量及品質均受到嚴重影響。依賴于CBF(C-repeat binding factor)轉錄因子的ICE1-CBF-COR信號轉導途徑是植物響應低溫脅迫信號的重要途徑之一[7-8]。此外,擬南芥、大麥、玉米、水稻、小麥、葡萄和番茄等作物CBF基因的功能已經被廣泛研究[10,16-18,28-30]。本研究探究了與擬南芥同屬十字花科的結球甘藍BoCBF基因的低溫誘導特性,對進一步解析BoCBF基因響應低溫脅迫具有重要的意義。

AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因串聯排列在擬南芥4號染色體上。在結球甘藍中,僅BoCBF1和BoCBF3串聯排列在8號染色體上,BoCBF2a位于7號染色體,BoCBF2b和BoCBF2c串聯分布在3號染色體上。推測結球甘藍中與擬南芥AtCBF2同源的BoCBF2基因發生了基因復制或丟失現象,導致加倍后的BoCBF2a、BoCBF2b、BoCBF2c基因與BoCBF1和BoCBF3不在同一條染色體上。此外,研究發現除BoCBF2b和BoCBF2c含有內含子序列外,其他BoCBF基因與擬南芥AtCBF基因結構一致,均無內含子結構,表明CBF基因在植物進化過程中具有較高的保守性。與BoCBF2a基因結構相比,發生全基因組三倍化事件后形成的BoCBF2b和BoCBF2c基因結構在進化過程中發生了變異,出現了較長的內含子序列,導致其基因功能也隨之發生了變化。

擬南芥中AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3基因不依賴ABA信號轉導,受低溫脅迫誘導表達,是低溫誘導的關鍵基因[7-8]。本研究發現結球甘藍923和D9中BoCBF1、BoCBF2a、BoCBF3、BoCBF4a和BoCBF4b基因受低溫脅迫誘導表達,而結球甘藍923和D9中BoCBF2b、BoCBF2c被發現不受低溫脅迫誘導表達。其中,結球甘藍D9中BoCBF4a和BoCBF4b基因在低溫處理6 h后至24 h時表達量上升,可能是由于受到節律調節或者光調控的影響。結合轉錄組測序和實時熒光定量PCR分析發現,耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9中BoCBF2a基因響應低溫脅迫誘導最為迅速,其次是BoCBF1和BoCBF3。本研究還發現在耐寒結球甘藍923和不耐寒結球甘藍D9中BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因受低溫脅迫誘導后基因相對表達量變化趨勢均為先上升后下降,僅表達水平出現高低的差異。綜上所述,本研究結果為后續開展BoCBF1、BoCBF2a和BoCBF3基因調控結球甘藍響應低溫脅迫機理研究奠定了基礎。