麻杏石甘湯對咳嗽變異型哮喘大鼠IL-6/STAT3信號通路及TRPV1感受器的影響

楊倩， 江波， 孫勤國， 呂琨， 羅蒙， 黃天慧

（武漢市第三醫院中醫科，湖北武漢 430000）

咳嗽變異型哮喘（cough variant asthma，CVA）是以慢性咳嗽為主要或唯一臨床表現的一類特殊型哮喘，多因反復暴露于特定過敏原引起。CVA具有病程長、易反復的特點，抗生素、祛痰藥、黏液溶解藥、鎮咳藥或β-腎上腺素能激動劑等均對其無治療效果[1-2]。CVA 的發病機制及病理生理與典型哮喘相似，均以持續氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重構為特點[3]。既往體內外研究證明，麻杏石甘湯及其拆解處方在改善哮喘氣道高反應性、抗過敏和抗炎方面都具有顯著療效[4]。本課題組前期臨床研究也發現，麻杏石甘湯對大鼠哮喘有緩解作用，但其具體作用機制尚不清楚。白細胞介素6（IL-6）是重要的促炎因子，可與細胞膜上的gp130 相互作用，使信號轉導和轉錄激活子3（STAT3）發生磷酸化，產生多種生物效應，與哮喘氣道炎癥密切相關[5]。瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）作為一種傷害性感受器，幾乎遍布整個呼吸系統，通過感知各種外源性或內源性的刺激，既能促進哮喘的一系列病理過程，又能限制哮喘的炎癥和免疫反應[6]。因此，本研究構建CVA大鼠模型，觀察麻杏石甘湯對IL-6/STAT3 信號通路及TRPV1 感受器的影響，探討其對CVA 的治療作用及機制，以期為臨床應用提供參考，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 60只4周齡雄性SD大鼠，體質量90~110 g，購自湖北貝恩特生物科技有限公司，實驗動物生產許可證：SCXK（鄂）20210027。飼養環境為SPF級動物房，大鼠自由飲食、活動，所有實驗操作符合實驗室規定，本研究通過武漢市第三醫院動物倫理委員會批準（批號：2022-05-160）。

1.2 藥物、試劑與儀器 麻杏石甘湯處方組成：麻黃9 g，杏仁9 g，生石膏18 g，炙甘草6 g，由武漢市第三醫院院內煎制，濃縮至全方生藥量2 g/mL。STAT3 激活劑Colivelin（Col，美國MCE 公司，批號：HY-P1061）；卵清蛋白（美國Sigma公司）；單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物公司）；IL-6、STAT3、TRPV1等一抗（美國Abcam公司）。肺功能分析系統（北京貝蘭博科技有限公司）；呼吸機（寰熙醫療公司）；誘咳引喘儀（上海玉研科學儀器有限公司）。

1.3 分組、造模與給藥 將60只大鼠隨機分為正常組，模型組，麻杏石甘湯低、高劑量組，麻杏石甘湯高劑量+Col 組，每組12 只。除正常組外，其他各組大鼠構建CVA模型[7]。造模方法：給予大鼠隔天腹腔注射1 mL 增敏劑（含1 mg 卵清蛋白和10 mg氫氧化鋁），共注射7次后，將大鼠放入點燃艾條的煙熏柜中2 h，每日2 次，持續40 d。造模結束后，大鼠表現出毛發干燥，活動減少，出現呼吸急促、打噴嚏、喘息、煩躁不安等哮喘發作相關癥狀，則說明模型建立成功。根據《中國藥理實驗方法學》[8]公式，使用成人劑量換算大鼠等效用藥量，麻杏石甘湯低、高劑量組大鼠分別灌胃3.5、7.0 g·kg-1·d-1的麻杏石甘湯；麻杏石甘湯高劑量+Col組大鼠灌胃麻杏石甘湯7.0 g·kg-1·d-1，腹腔注射Col 0.5 mg·kg-1·d-1[9]；正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水。每日1次，連續給藥7 d。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 體征觀察 給藥結束后，觀察和對比各組大鼠皮毛、活動、哮喘、呼吸等一般體征的變化。

1.4.2 咳嗽次數觀察 給藥結束后，將大鼠置于誘咳引喘儀霧化盒中使之吸入辣椒素霧化劑（1×10-4mol/L）[10]，持續時間60 s，停止刺激，記錄各組大鼠2 min內的咳嗽次數。

1.4.3 氣道阻力（RE）檢測 大鼠禁食12 h后，使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，切開氣管進行氣管插管并連接肺功能分析系統和呼吸機。靜脈注射生理鹽水后立即記錄RE 作為基礎值，每隔5 min 依次靜脈注射0.025、0.05、0.1 mg/kg 的乙酰膽堿，測定RE。

1. 4. 4 EOS 計數 麻醉大鼠，結扎右側主支氣管，經氣管插管，使用預冷的Hanks液灌洗支氣管肺泡6 次，每次0.5 mL?；厥罩夤芊闻莨嘞匆?，離心后取沉淀，經生理鹽水重懸，取10 μL細胞懸液涂片。Diff-Quik染色涂片后進行EOS計數。

1.4.5 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肺、支氣管組織病理學特征 處死大鼠后，取右肺組織和支氣管組織，生理鹽水沖洗，將組織浸泡于4%多聚甲醛溶液固定，制作石蠟切片。蘇木素-伊紅（HE）染色后在顯微鏡下觀察組織的病理學特征。

1. 4. 6 ELISA 法測定肺組織MCP-1、TNF-α含量 取肺組織，剪碎，勻漿，于4 ℃離心20 min，取上清。按照ELISA 試劑盒操作要求檢測上清樣本中MCP-1、TNF-α的含量。

1.4 加工技術水平較高：紅干辣椒分批采收，采收后自然風干，分戶保管儲藏。辣椒加工由原來簡單的加工已發展到工廠加工。整個加工過程采用半自動化管理，只有在包裝環節由專門人員來完成。這不僅使產品有了安全衛生保證，而且降低了生產成本。辣椒產品由原來只加工辣椒粉，現已開發出了辣椒絲、辣椒油、辣椒醬、辣椒粉等系列產品，出口南韓、香港、南非及東南亞。

1. 4. 7 Western Blot 法檢測肺組織IL-6、STAT3、TRPV1 蛋白表達 取肺組織，勻漿，離心，取上清。定量上清蛋白濃度，在凝膠中上樣，電泳，轉膜。使用胎牛血清封閉PVDF膜，剪切樣品目的條帶孵育在IL-6、STAT3、TRPV1抗體稀釋液（1∶1 000）中4 ℃過夜，室溫下加入二抗孵育1 h，滴加發光液，顯影。使用ImageJ 軟件分析蛋白表達水平，結果以目的蛋白與內參蛋白的灰度值比值表示，內參為GAPDH。

1.5 統計方法 采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體征變化比較 正常組大鼠毛發光亮，飲食活動無異常，呼吸平穩，無異?？人?、喘息現象；模型組大鼠毛發干燥，活動減少，呼吸急促，打噴嚏，喘息，煩躁不安；相較于模型組，麻杏石甘湯低、高劑量組大鼠毛發光澤度增加，哮喘明顯改善，呼吸較均勻；相較于麻杏石甘湯高劑量組，麻杏石甘湯高劑量+Col 組大鼠哮喘加重，其他體征與模型組類似。

2.2 各組大鼠咳嗽次數比較 表1 結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠咳嗽次數增加（P＜0.05）；與模型組比較，麻杏石甘湯低、高劑量組大鼠咳嗽次數呈劑量依賴性減少（P＜0.05）；與麻杏石甘湯高劑量組比較，麻杏石甘湯高劑量+Col組大鼠咳嗽次數增加（P＜0.05）。

表1 各組大鼠咳嗽次數比較Table 1 Comparison of cough frequency of rats among various groups（）

表1 各組大鼠咳嗽次數比較Table 1 Comparison of cough frequency of rats among various groups（）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與麻杏石甘湯低劑量組比較；④P＜0.05，與麻杏石甘湯高劑量組比較

咳嗽次數/次1.50±0.17 5.92±0.60①4.25±0.51②2.75±0.32②③5.33±0.57④185.603＜0.001組別正常組模型組麻杏石甘湯低劑量組麻杏石甘湯高劑量組麻杏石甘湯高劑量+Col組F值P值鼠數/只12 12 12 12 12

2.3 各組大鼠RE比較 表2結果顯示：在0.025、0.05、0.1 mg/kg 等3種劑量乙酰膽堿的刺激下，與正常組比較，模型組RE升高（P＜0.05）；與模型組比較，麻杏石甘湯低、高劑量組大鼠RE劑量依賴性降低（P＜0.05）；與麻杏石甘湯高劑量組比較，麻杏石甘湯高劑量+Col組大鼠RE升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠氣道阻力（RE）比較Table 2 Comparison of airway resistance（RE）of rats among various groups（）

表2 各組大鼠氣道阻力（RE）比較Table 2 Comparison of airway resistance（RE）of rats among various groups（）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與麻杏石甘湯低劑量組比較；④P＜0.05，與麻杏石甘湯高劑量組比較

不同濃度乙酰膽堿刺激下RE/Pa 0.1 mg/kg 0.74±0.09 1.12±0.10①0.98±0.09②0.82±0.09②③1.06±0.11④33.212＜0.001組別正常組模型組麻杏石甘湯低劑量組麻杏石甘湯高劑量組麻杏石甘湯高劑量+Col組F值P值鼠數/只12 12 12 12 12 0.025 mg/kg 0.35±0.04 0.52±0.06①0.45±0.05②0.39±0.04②③0.48±0.05④23.750＜0.001 0.05 mg/kg 0.51±0.06 0.74±0.08①0.66±0.07②0.58±0.06②③0.70±0.09④19.443＜0.001

2.4 各組大鼠EOS 數目比較 表3 結果顯示：與正常組比較，模型組EOS 數目升高（P＜0.05）；與模型組比較，麻杏石甘湯低、高劑量組大鼠EOS數目呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；與麻杏石甘湯高劑量組比較，麻杏石甘湯高劑量+Col 組大鼠EOS數目升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠EOS數目比較Table 3 Comparison of EOS numbers among various groups of rats（）

表3 各組大鼠EOS數目比較Table 3 Comparison of EOS numbers among various groups of rats（）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與麻杏石甘湯低劑量組比較；④P＜0.05，與麻杏石甘湯高劑量組比較

EOS/（×106·個-1）0.12±0.02 3.80±0.41①2.36±0.34②1.66±0.18②③3.32±0.46④239.855＜0.001組別正常組模型組麻杏石甘湯低劑量組麻杏石甘湯高劑量組麻杏石甘湯高劑量+Col組F值P值鼠數/只12 12 12 12 12

2. 5 各組大鼠肺、支氣管組織病理學特征比較 肺組織HE染色結果顯示：正常組肺組織結構清晰完整；模型組肺組織炎性細胞浸潤嚴重；與模型組比較，麻杏石甘湯低、高劑量組炎性細胞浸潤顯著減少；麻杏石甘湯高劑量+Col組肺組織損傷較麻杏石甘湯高劑量組嚴重。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結果（×200）Figure 1 HE staining results of lung tissue of rats among various groups（×200）

支氣管組織HE染色結果顯示：正常組支氣管纖毛排列整齊，未見炎性細胞浸潤、細胞脫落跡象；模型組上皮細胞壞死、纖毛粘連甚至倒伏，黏液多；與模型組比較，麻杏石甘湯低、高劑量組上皮細胞損傷顯著減輕，黏液分泌一定程度上減少；麻杏石甘湯高劑量+Col 組組織及細胞損傷嚴重，染色結果與模型組類似。見圖2。

圖2 各組大鼠支氣管組織HE染色結果（×200）Figure 2 HE staining results of bronchial tissue of rats in each group（×200）

2. 6 各組大鼠肺組織MCP-1、TNF-α 含量比較 表4 結果顯示：與正常組比較，模型組MCP-1、TNF-α 含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，麻杏石甘湯低、高劑量組MCP-1、TNF-α 含量呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；與麻杏石甘湯高劑量組比較，麻杏石甘湯高劑量+Col 組MCP-1、TNF-α含量升高（P＜0.05）。

表4 各組大鼠肺組織MCP-1、TNF-α含量比較Table 4 Comparison of MCP-1 and TNF-α contents in lung tissues of rats among various groups（，ng·mL-1）

表4 各組大鼠肺組織MCP-1、TNF-α含量比較Table 4 Comparison of MCP-1 and TNF-α contents in lung tissues of rats among various groups（，ng·mL-1）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與麻杏石甘湯低劑量組比較；④P＜0.05，與麻杏石甘湯高劑量組比較

TNF-α 1.23±0.15 4.57±0.52①3.48±0.50②2.12±0.25②③4.10±0.54④64.904＜0.001組別正常組模型組麻杏石甘湯低劑量組麻杏石甘湯高劑量組麻杏石甘湯高劑量+Col組F值P值鼠數/只12 12 12 12 12 MCP-1 4.67±0.53 12.17±1.44①8.92±1.03②6.39±0.71②③11.45±1.41④52.341＜0.001

2.7 各組大鼠肺組織IL-6、STAT3、TRPV1 蛋白表達比較 圖3 和表5 結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺組織IL-6、STAT3、TRPV1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，麻杏石甘湯低、高劑量組大鼠肺組織IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表達水平呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；與麻杏石甘湯高劑量組比較，麻杏石甘湯高劑量+Col組大鼠肺組織IL-6、STAT3、TRPV1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠肺組織IL-6、STAT3、TRPV1的Western Blot條帶Figure 3 Western Blot bands of IL-6，STAT3 and TRPV1 in lung tissue of rats in each group

表5 各組大鼠肺組織IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表達比較Table 5 Comparison of protein expressions of IL-6，STAT3 and TRPV1 in lung tissue of rats among various groups（）

表5 各組大鼠肺組織IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表達比較Table 5 Comparison of protein expressions of IL-6，STAT3 and TRPV1 in lung tissue of rats among various groups（）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與麻杏石甘湯低劑量組比較

組別正常組模型組麻杏石甘湯低劑量組麻杏石甘湯高劑量組麻杏石甘湯高劑量+Col組F值P值TRPV1/GAPDH 0.34±0.05 0.75±0.08①0.60±0.07②0.39±0.05②0.71±0.07③27.674＜0.001鼠數/只6 6 6 6 6 IL-6/GAPDH 0.15±0.02 0.38±0.04①0.29±0.03②0.20±0.02②0.36±0.04③60.801＜0.001 STAT3/GAPDH 0.70±0.08 0.98±0.09①0.86±0.07②0.73±0.08②0.95±0.09③14.103＜0.001

3 討論

咳嗽變異性哮喘（CVA）歸屬于中醫學“久咳”“頑咳”“久嗽”等范疇，風、寒、熱、瘀為主要病因，宿痰伏肺為主要病機，治療應注重正邪盛衰，降氣止咳，清熱宣肺。麻杏石甘湯為解表劑，方中：麻黃宣肺解表平喘；石膏清肺胃熱以生津；杏仁苦降肺氣、止咳平喘，既助石膏沉降下行，又助麻黃瀉肺熱；炙甘草調和麻黃、石膏之寒溫，保護胃氣。共奏辛涼宣泄、清肺平喘之功。研究[11]證實，麻杏石甘湯有明顯鎮咳、祛痰功效，能夠增強免疫反應、減輕炎癥。本研究結果顯示，麻杏石甘湯治療后，CVA 大鼠毛發光澤度增加，呼吸平穩，咳嗽次數減少，說明麻杏石甘湯能夠減輕CVA癥狀。

EOS是免疫反應和過敏反應過程中極為重要的細胞，其浸潤到支氣管上皮細胞會引起哮喘，促進EOS凋亡可以緩解哮喘氣道炎性反應[12]。支氣管對非特異性刺激反應過度收縮，會導致氣道狹窄和RE增加，即氣道高反應性（AHR）。AHR被認為是哮喘的關鍵特征之一，且與哮喘發病率正相關[13]。研究[14]發現，CVA 患者表現出氣道功能障礙，RE 明顯高于非CVA 人群。本研究結果顯示，模型組大鼠RE 較正常組升高，EOS 上調，麻杏石甘湯組CVA 大鼠RE 值和EOS 較模型組顯著降低，提示麻杏石甘湯具有改善CVA的功能。

哮喘是由多種細胞和炎癥因子參與的氣道慢性炎癥性疾病[15]。MCP-1 和TNF-α 是免疫炎癥反應的代表性細胞因子，減少MCP-1、TNF-α 的過多分泌可改善哮喘[16]。本研究發現，CVA大鼠肺組織炎性細胞浸潤嚴重，支氣管上皮細胞壞死、纖毛粘連甚至倒伏，黏液分泌較多，且肺組織MCP-1、TNF-α 含量增加，說明CVA 大鼠肺和支氣管存在明顯的炎癥反應；麻杏石甘湯治療后，CVA大鼠氣道炎癥反應和病理損傷明顯減輕。

IL-6 是一種多效性促炎細胞因子，它的抑制/過表達與慢性炎癥和多因素自身免疫性疾病有關[17]。STAT3是調節參與免疫反應的基因的核轉錄因子，決定了細胞如何整合接收到的環境信號，并最終將它們轉化為特定基因組的轉錄調控[18]。核因子（NF）-κB 和STAT3 協同作用誘導NF-κB 過度激活，產生IL-6 等多種炎性細胞因子，因此非免疫細胞NF-κB 和STAT3 同時激活觸發IL-6/STAT3軸，激活NF-κB 的正反饋回路，引發非免疫細胞和免疫細胞的相互作用，造成自身免疫疾病[16]。研究[19]發現，抑制IL-6/STAT3 信號通路顯著減輕了卵清蛋白誘導的CVA 小鼠的嚴重程度。本研究結果顯示，模型組大鼠肺組織IL-6、STAT3 蛋白表達水平較正常組升高，麻杏石甘湯組IL-6、STAT3蛋白表達水平較模型組顯著下降，表明麻杏石甘湯對CVA 大鼠的治療作用可能與抑制IL-6/STAT3信號通路有關。Col是IL-6/STAT3通路的激活劑，本研究另設置了麻杏石甘湯與Col聯合處理組，相較于麻杏石甘湯單獨處理組，CVA 大鼠肺及支氣管病理損傷加重，IL-6、STAT3蛋白表達升高，充分驗證了麻杏石甘湯對CVA 大鼠的治療作用與抑制IL-6/STAT3軸活化有關。

TRPV1 是瞬時受體感受器電位通道的成員，可被多種刺激內源性炎癥因子等激活，TRPV1 的激活會引起咳嗽反射反應，形成咳嗽高敏感性，也會誘導神經肽的釋放，造成氣管黏膜水腫、支氣管收縮等[20]。在急性發作期，感覺神經細胞的TRPV1被激活，引起Ca2+內流和動作電位產生，誘發了咳嗽反射，而在慢性持續期，過敏原作用于TRPV1，介導胞內轉錄和磷酸化等級聯反應，導致了氣道高反應性和氣道重塑[6，21-22]。本研究發現，CVA 大鼠肺組織TRPV1 蛋白表達升高，麻杏石甘湯可以降低CVA 大鼠TRPV1 的表達，減輕咳嗽的敏感性。

綜上所述，麻杏石甘湯可有效改善大鼠咳嗽變異性哮喘，其機制與抑制IL-6/STAT3 信號通路活化及TRPV1高表達有關。