基于TCGA研究左右半結腸癌基因表達差異及苦參-大血藤-半枝蓮作用機制

劉菁菁， 張恩欣

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.深圳市寶安純中醫治療醫院，廣東深圳 518100）

基于左、右半結腸在生理功能、解剖學、胚胎學等方面的差異，左、右半結腸癌的臨床癥狀、治療反應性及預后等方面均存在顯著差異。如：左半結腸癌常見梗阻、血便，右半結腸癌常見腹脹、腹痛等非特異性癥狀；對比左半結腸癌，右半結腸癌對人表皮生長因子受體（EGFR）和西妥昔單抗療效反應欠佳；右半轉移性結腸癌預后明顯差于左半轉移性結腸癌[1]。由于惡性腫瘤是致瘤因素作用下局部組織細胞在基因水平對細胞增殖失控導致的單克隆性增殖疾病，故本研究嘗試利用癌癥基因組圖譜（TCGA）分析左、右半結腸癌的基因表達差異，從基因層面解釋左、右半結腸癌的臨床差異。

另一方面，已有研究通過挖掘腸癌方劑數據庫篩選出中醫治療大腸癌的核心藥對苦參-大血藤-半枝蓮[2]，該藥對具有抗癌解毒、濕毒并治的功效特點，作為腸癌的辨病治療專藥意義重大。但該藥對在左右半結腸癌的治療效果及機制方面是否存在差異尚有待研究，故本研究擬通過網絡藥理學結合左右半結腸癌差異表達基因篩選的方法探究其具體機制，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據收集 利用TCGA下載工具gdc-client按照樣本來源部位分別下載左、右半結腸癌及相應癌旁組織的轉錄組高通量測序計數（highthroughput sequencing counts，HTSeq counts）。

1.2 數據處理 利用R 4.1.0的rjson包提取下載樣本的條形碼（barcode）；利用R 提取Ensemble ID 在每一個barcode 中的表達量；通過gencodgenes 數據庫下載人類參考基因組GRch38基因注釋文件，基于該注釋文件，將Ensemble ID 轉換為基因名（Gene Symbol），最終獲得Gene Symbol 在每個barcode 代表樣本的計數矩陣。利用R 的stringR包，根據樣本barcode 區分癌組織與癌旁組織，設置癌組織為實驗組，癌旁組織為對照組。

1. 3 差異基因分析及統計方法 應用統計方法R 包DESeq2[3]處理計數矩陣，設篩選條件為P＜0.05，差異倍數絕對值|Abs（log2FoldChange）|＞1，分別篩選左半結腸癌實驗組與對照組，右半結腸癌實驗組與對照組的差異基因， 并根據log2FoldChange 的正負值標注基因上調、下調情況，應用edgeR 包[4]對上述結果進行驗證，篩選條件同上，最終篩選出兩種統計學方法共同提示差異表達，且上調、下調一致的基因標定為差異基因，根據差異基因來源分別構建差異基因數據集，繪制火山圖。將篩選得出包含基因上調及下調信息的左半結腸癌與右半結腸癌差異基因數據集通過R的VennDiagram[5]提取交集并繪制韋恩圖。

1. 4 差異基因過表征分析（Over-Representation Analysis，ORA） 利用R 軟件Clusterprofiler 包[6]的富集KEGG功能分別對左半結腸癌差異基因、右半結腸癌差異基因、共同差異基因進行ORA KEGG富集分析，篩選差異基因富集的生物學過程，應用R 的“enrichplot”功能，分別繪制條形圖、氣泡圖，篩選與發病相關的左、右半結腸癌特異性通路及共同通路。

1. 5 差異基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA） 由于ORA 法不考慮基因表達的差異程度[7]，故對左/右半結腸癌差異基因數據集分別補充GSEA KEGG[8]富集分析，差異基因的Abs（log2FoldChange）可反映基因表達的差異程度，其取值均選擇來自DESeq2，根據結果篩選與發病相關的左、右半結腸癌特異性通路及共同通路作為補充。

1.6 基于左右半結腸癌差異表達基因的腸癌核心藥對網絡藥理學研究 利用BATMAN-TCM[9]設置篩選條件Score cutoff＞20，P＜0.05，構建苦參-大血藤-半枝蓮藥對活性成分-靶點數據集，利用Cytoscape 3.7.2 軟件構建藥對活性成分-靶點可視化網絡，篩選核心化合物。利用VennDiagram提取藥對靶點數據集與“1.3”項中左、右半結腸癌疾病靶點的交集，在線繪制蛋白質互作（PPI）網絡，篩選核心靶點，并對核心靶點進行ORA KEGG富集分析，探討藥對治療左、右半結腸癌的機制差異。

2 結果

2.1 數據收集 利用TCGA 數據庫下載左半結腸癌、右半結腸癌的HTSeq counts文件。最終納入研究的病例數為328 例。其中左半結腸癌組134 例，包括乙狀結腸112 例，降結腸17 例，橫結腸左側1/3（包含結腸脾曲）5例。右半結腸癌組194例，包括盲腸95 例，升結腸84 例，橫結腸右側2/3（包括結腸肝曲）15例。

2. 2 數據處理 利用R 提取barcode，基于GRch38 注釋文件實現Ensemble ID 到Gene Symbol轉換，結果顯示左半結腸癌組的barcode 共計150 個，對應的組織樣本數為150 個，表達基因55 277種，右半結腸癌組的barcode共計221個，對應的組織樣本數為221 個，表達基因55 277 種。R 軟件通過stringR 包實現癌組織與癌旁組織區分。最終顯示150 個左半結腸癌組織中癌組織140 個（左半實驗組），癌旁組織10 個（左半對照組），221 個右半結腸癌組織中癌組織204 個（右半實驗組），癌旁組織17個（右半對照組）。

2.3 差異基因分析 分別對左半實驗組與左半對照組、右半實驗組與右半對照組進行DESeq2 分析，edgeR 驗證，繪制火山圖（見圖1）。結果顯示：左半結腸癌差異基因共8 009 個，其中上調4 685 個，下調3 324 個；右半結腸癌差異基因共7 790 個，其中上調4 629 個，下調3 161 個。R 軟件VennDiagram包提取上述兩差異基因數據集的交集，得到韋恩圖（見圖2），重疊部分提示左半結腸癌與右半結腸癌相對于正常癌旁組織共同的差異表達基因共6 051個，左半結腸側非重疊部分提示左半結腸癌特異性的差異表達基因共1 958個，右半結腸側非重疊部分提示右半結腸癌特異性的差異表達基因共1 739個。其中LINC02889、SAX02、HOXB13基因在左右半結腸癌均有表達，但在右半結腸癌表現為上調，左半結腸癌表現為下調，同計為特異性的差異基因。

圖1 左/右半結腸癌差異基因火山圖Figure 1 Volcano map of differential genes for left/right-sided colon cancers

圖2 左、右半結腸癌差異基因韋恩圖Figure 2 Venn diagram of differential genes for leftsided and right sided colon cancer

2.4 差異基因過表征分析 對“2.3”項獲取的差異基因進行ORA KEGG 富集分析，通過enrichplot功能分別實現左半結腸癌特異性差異基因、右半結腸癌特異性差異基因、共同差異基因結果的可視化。結果顯示：左半結腸癌特異性差異基因富集的生物信號通路包含T 細胞受體信號通路、Th1和Th2細胞分化通路等共10條（見圖3）；右半結腸癌特異性富集的生物信號通路包含色氨酸代謝通路與酒精中毒等共7 條（見圖4）；左右半結腸癌共同的差異基因表達共富集于44 條信號通路（見圖5），其中，PI3K-Akt 信號通路、Ras 信號通路、Wnt信號通路等均為涉及人類腫瘤疾病發生發展的重要信號通路，提示上述通路在結腸癌發病過程中的非特異性作用。

圖3 左半結腸癌差異基因富集通路條形圖Figure 3 Bar graph of differential gene enrichment pathway in left-sided colon cancer

圖4 右半結腸癌差異基因富集通路條形圖Figure 4 Bar graph of differential gene enrichment pathway in right-sided colon cancer

圖5 左右半結腸癌共同差異基因富集通路條形圖（P值前25條）Figure 5 Bar graph of common differential geneenriched pathways in left-and right-sided colon cancers（top 25 P-values）

2.5 差異基因富集分析 基于基因表達的差異程度利用R 軟件實現GSEA KEGG 富集分析，將結果可視化。得到左半結腸癌差異基因富集通路共35 條（見圖6），右半結腸癌組織差異基因富集通路共48 條（見圖7），其中共同通路30 條，左半結腸癌特異性通路5條，右半結腸癌特異性通路18條。

圖6 左半結腸癌差異基因富集通路（GSEA）山脊圖Figure 6 Ridge map of Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）of differential gene-enriched pathways in leftsided colon cancers

圖7 右半結腸癌差異基因富集通路（GSEA）山脊圖Figure 7 Ridge map of Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）of differential gene-enriched pathways in rightsided colon cancers

2.6 基于左右半結腸癌差異基因表達的腸癌核心藥對網絡藥理學研究 利用BATMAN-TCM 數據庫，得到苦參活性化合物73種，對應靶點382個，大血藤活性化合物3種，對應靶點117個，半枝蓮活性化合物9 種，對應靶點55 個，構成藥對后靶點合計469 個。利用Cytoscape 3.7.2 軟件構建藥對活性化合物-靶點可視化網絡（見圖8），篩選核心化合物。根據度（Degree）值計算出核心化合物：壬酸（Degree =107）、癸酸（Degree =107）、月桂酸（Degree=107）、谷甾醇（Degree = 102）、羽扇豆酮（Degree=54）等，上述化合物可能為藥對發揮作用的主要成分。利用VennDiagram 提取藥對-疾病共同靶點，結果顯示，藥對-左半結腸癌靶點交集184 個，藥對-右半結腸癌靶點交集185 個。利用ORA KEGG 法，分析藥物-疾病靶點富集的生物通路，得到藥對-左半結腸癌富集通路46 條，藥對-右半結腸癌富集通路37 條，繪制氣泡圖（見圖9）。結果顯示：共同通路36 條，藥對-左半結腸癌特異性通路10 條，藥對-右半結腸癌特異性通路1 條。利用String 數據庫[10]在線構建PPI 網絡（見圖10、圖11），利用Cytoscape 的CytohHub 插件根據Degree 篩選核心蛋白，列舉左半結腸癌、右半結腸癌核心蛋白前20位（見表1）。

表1 藥對-結腸癌核心蛋白Table 1 Drug pair-colon cancer core protein

圖8 藥對活性化合物-靶點網絡圖Figure 8 Drug-pair active compounds-target networks map

圖11 藥對-右半結腸癌PPI網絡Figure 11 PPI network of drug pair-right-sided colon cancer

3 討論

3.1 左右半結腸癌差異表達基因富集通路分析 在分子生物學特征分析中，本研究通過ORA 法發現左半結腸癌的特異性差異基因主要富集在以下10 條信號通路：金黃色葡萄球菌感染、造血細胞譜系、同種異體移植排斥反應、移植物抗宿主病、細胞黏附分子、Th1和Th2細胞分化、Ⅰ型糖尿病、T細胞受體信號通路、膽堿能突觸、自身免疫性甲狀腺疾病。以上通路揭示免疫機制異?？赡軈⑴c左半結腸癌的發病過程。其中，T細胞受體信號通路參與機體T 淋巴細胞的活化過程，包括CD28 等在內的共信號分子與T 細胞受體有效結合才能使T淋巴細胞正?；罨?，進而發揮細胞免疫功能[11]。在該通路中，本研究結果顯示，左半結腸癌組織的T 細胞共信號分子CD28、T 細胞表面抗原CD4，體細胞激酶IL2 及直接參與免疫反應的IL10等10 余種分子表達水平均較正常組織顯著下調，提示細胞免疫功能抑制可能參與左半結腸癌發病。另有相關研究顯示，共信號分子CD28與臨床廣泛應用的程序性死亡受體1 類藥物（PD-1）通路存在互作關系，阻斷CD28 分子或剔除CD28 基因均阻斷PD-1作用后T細胞的增殖過程，影響PD-1療效[12]，故CD28 與左半結腸癌發病及免疫檢查點抑制劑療效的關系有待進一步行單基因研究探析。左半結腸癌富集的其余通路表明，其發病可能與自身免疫類疾病相關。相關研究顯示，20%~40%的炎性腸病會發展為炎性腸病相關性結直腸癌，其關鍵通路可能涉及核因子κB 通路[13]，但炎性腸病相關性結腸癌是否在左半結腸癌與右半結腸癌存在明顯差異仍有待進一步研究。另一方面，本研究基于基因差異程度通過GSEA法補充發現了左半結腸癌的5條特異性信號通路，其中單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）通路在癌癥、糖尿病等疾病中發揮著重要作用。目前，學術界對AMPK通路存在兩種相反觀點，即AMPK通路中的不同亞通路可能同時介導了促進或抑制腫瘤的生長、轉移、血管生成兩種相反的生物功能。最新研究[14]顯示，AMPK促癌或抑癌的效應可能取決于腫瘤的發展階段，在腫瘤前期可能起抑制效應，在腫瘤形成后則表現為促瘤效應。本研究結果顯示，左半結腸癌組織中包括AMPK、IGF1、mTORC2 在內的14 種分子表達水平均下調，可能與腫瘤生長過程中AMPK 抑瘤功能的激活相關，而作為AMPK 激動劑的二甲雙胍目前被多項整合研究發現可降低多種腫瘤發病風險[15]，其在左半結腸癌的輔助療法應用價值有待進一步挖掘。

同時，本研究基于ORA 法發現，右半結腸癌差異基因富集于以下7條通路：中性粒細胞外陷阱形成（NET formation）、系統性紅斑狼瘡、病毒蛋白與細胞因子及細胞因子受體的相互作用、酒精中毒、金黃色葡萄球菌感染、細胞因子-細胞因子受體的相互作用、色氨酸代謝。經相關文獻研究分析，中性粒細胞外陷阱形成、酒精中毒信號通路可能與右半結腸癌疾病進程存在相關性。中性粒細胞外陷阱形成是中性粒細胞釋放其去濃縮染色質并形成細胞外DNA 網絡的生物過程，既往研究揭示其廣泛參與感染及炎性疾病[16]。而隨著研究深入，有一定數量的研究顯示該生物過程同樣可被腫瘤類疾病誘導并促進腫瘤進展，其促瘤機制可能與中性粒細胞誘導腫瘤微環境中的基質金屬蛋白酶9（MMP9）、制瘤素M（OSM）活性進而促使腫瘤發生浸潤、轉移、血管生成的生物學行為相關[17-18]。作為中性粒細胞外陷阱形成過程的重要標志物瓜氨酸化組蛋白H3（citH3）在腫瘤患者中顯著提高，citH3 升高提高了腫瘤患者的死亡風險，表明中性粒細胞外陷阱形成提示腫瘤疾病預后不良[19]，為右半結腸癌的預后評估提供了具有研究價值的生物標志物。本研究中富集于該通路的28 個分子有26個顯著上調，其中包括citH3，進一步證明中性粒細胞外陷阱形成生物過程可能密切參與右半結腸癌的發生發展，其產物citH3對右半結腸癌可能是評估預后的有效生物學標志。目前已有較大量的研究支持結腸癌的危險因素包括遺傳、飲食、炎性腸病、微量元素失衡等，另有27 項隊列研究顯示酒精暴露使結直腸癌患癌風險升高1~1.7 倍[20]；但目前暫無研究明確酒精暴露與結腸癌發病位置的相關性。故基于本研究富集通路結果可進一步開展左右半結腸癌基于酒精暴露的危險因素分析。作為補充的GSEA 分析共富集18 條信號通路，其中中性粒細胞外陷阱形成通路同樣被GSEA法富集，再次證明中性粒細胞外陷阱形成通路可能與右半結腸癌相關。在18條通路中，Hippo信號通路對腸穩態起重要作用，Hippo通路的失調控可導致腸上皮的惡性轉化，其機制與Hippo信號通路上的YAP/TAZ 效應蛋白表達上調及與Wnt 通路形成交叉作用有關，在腫瘤形成后，YAP 的上調又直接介導了結腸癌細胞對化療藥物5-氟尿嘧啶、抗EGFR 單抗西妥昔單抗等常用藥物的耐藥性[21-22]。在本研究中，右半結腸癌樣本有23個富集于該通路的蛋白水平顯著上調，其中包括YAP/TAZ 的正向調控因子TEA 結構域轉錄因子、交叉通路WNT 通路的受體蛋白FZD 及下游經典癌基因MYC 編碼的DNA 結合蛋白，因此認為右半結腸癌的Hippo通路存在明顯異常。目前較多的回顧性研究數據顯示右半結腸癌預后明顯差于左半結腸癌，且右半結腸癌使用西妥昔單抗的療效差于左半結腸癌，這與本研究發現的右半結腸癌差異基因特異性富集于Hippo 通路結果具有一致性。Hippo通路異?？赡苁亲?、右結腸癌在預后及藥物反應性上存在差異的機制之一。

3.2 腸癌核心藥對治療左右半結腸癌的機制探析 苦參-大血藤-半枝蓮藥對是基于《腫瘤方劑大辭典》《腫瘤良方大全》《中國藥典》等構建的大腸癌方劑數據庫，嚴格采用支持度、置信度等統計參數篩選得到的腸癌核心藥對。在線數據庫獲得的該藥對活性成分主要包括苦參堿、氧化苦參堿、苦參黃酮、馬尾藻甾醇、大黃素、漢黃芩素、野黃芩素、異紅花素等，與目前已有的藥理學研究高度一致，表明此研究結果具有參考價值。

構建的活性化合物-靶點可視化網絡圖提示壬酸、癸酸、月桂酸、谷甾醇、羽扇豆酮等成分為藥對的核心化合物成分。有研究[23]顯示，月桂酸、癸酸、壬酸等中鏈飽和脂肪酸可靶向下調EGFR 1.33~1.58 倍，進而介導結腸癌細胞系HCT-15 凋亡，其抗腫瘤作用具有靶向性。有關植物甾醇類的動物模型實驗[24]顯示，包括谷甾醇在內的植物甾醇類可通過抑制細胞周期、誘導細胞凋亡等機制發揮抗結腸癌作用。又有納入1 802例結直腸癌與1 813 例對照的病例對照研究[25]顯示，既往植物甾醇總攝入量與結腸癌發病風險呈負相關，攝入植物甾醇可降低結直腸癌發病風險，揭示谷甾醇在內的植物甾醇類對結腸癌的“治未病”價值。羽扇豆酮被相關研究證實具有抗白血病細胞增殖作用[26]，但其具體抗癌機制仍有待進一步挖掘。

根據KEGG富集分析結果，藥對治療結腸癌的生物過程是復雜的，充分體現了中藥多靶點、多通路干預疾病的特點。在藥對干預左右半結腸癌的非特異性通路中主要有涉及調控細胞周期的通路，包括環磷酸鳥苷-蛋白激酶G（cGMP-PKG）通路、環磷酸腺苷（cAMP）通路、鈣信號通路，必需氨基酸代謝通路包括苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝通路。提示藥對可能通過上述通路對結腸癌產生非特異性的治療作用。細胞周期相關通路方面，cGMP-PKG通路參與細胞周期調控及逆轉EGFR磷酸化的生物過程，其機制與PKG 逆轉EGF 激活MAPK/ERK 通路相關[27]。cAMP 通路廣泛參與細胞增殖、分化及凋亡的調控，并以下游效應因子PKA 介導主要生物學功能。相關研究顯示，在惡性腫瘤細胞中，cAMP失去其雙向調控細胞周期的作用，轉而表現為促腫瘤細胞存活作用，其機制可能與cAMP 抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導腫瘤細胞死亡相關[28-29]。鈣信號通路則可通過誘導Caspase-12 促細胞凋亡[30]。相關研究[31]顯示，多種腫瘤細胞的鈣信號通路基因存在異常DNA 甲基化，其介導了腫瘤細胞中的鈣離子濃聚，并為細胞增殖提供條件。必需氨基酸代謝通路方面，腫瘤細胞普遍存在對必需氨基酸的增強吸收現象，包括研究發現的苯丙氨酸、酪氨酸在內必需氨基酸異常代謝均促進腫瘤惡性發展[32]。故本藥對還可通過影響必需氨基酸代謝途徑參與疾病治療。

藥對治療左半結腸癌的特異性通路共有10條，主要富集于涉及內分泌功能的信號通路及1條胃癌特異性通路，除外胃腸道的外分泌功能，伴隨相關研究進展，胃腸道作為“機體最大的內分泌器官”的概念被逐漸接受[33]，生理狀態下的胃腸道內分泌細胞分泌包括胃泌素在內的肽類激素，并介導胃酸、胰島素、生長激素、皮質激素等釋放，腸道內分泌細胞的腫瘤轉化則可表現出神經內分泌特征表型的腫瘤，臨床以神經內分泌功能異常為主要表現[34]。藥對可能基于調節腸道內分泌功能對左半結腸癌產生治療效應，但結論目前缺乏相關研究支持，有待進一步驗證。

藥對治療右半結腸癌富集的特異性通路為1 條，該通路主要參與瞬時受體電位（TRP）介導的炎癥反應[35]。特異性富集于該通路的原因可能與右半結腸癌的生理功能有關，由于右側結腸具有較強的吸收功能，腫瘤壞死缺血合并感染后病原體產生的毒素易被吸收進而引發感染性炎癥，故本藥對在右半結腸癌的治療中可能發揮較強的抗炎作用。

基于PPI 網絡的分析結果顯示，藥對作用的左、右半結腸癌的關鍵靶點存在一定的差異，在兩個PPI 網絡的前20 位中，藥對治療的共同關鍵靶點有13個，左、右半結腸癌特異性靶點各7個。但本研究結果發現，不論左半結腸癌還是右半結腸癌的關鍵靶點所編碼的蛋白在功能上都較多地參與了機體的精神情緒調控，其中包括DRD2、MAOA、 MAOB、 HTR3A、 HTR2A、 GRIN2A、GRIN2B、SLC6A3、SLC6A4等[36-38]，揭示本藥對可能通過調控精神情緒活動參與結腸癌治療過程。中醫學較早地認識到情志因素在惡性腫瘤發病的作用，即宋代嚴用和所言“憂、思、喜、怒之氣，人之所不能無者，過則傷五臟，……留結而為五積”，情志抑郁常致肝失疏泄，氣機失調氣血壅滯，致生腫瘤類疾病。且惡性腫瘤發病后不良情緒與疲乏、消化道癥狀等存在互作關系，影響生活質量[39]，即中醫學認為的情志抑郁，肝失疏泄，脾胃失去運化與升降也。故本藥對除外抗腫瘤效應的情緒調控作用亦具有臨床應用意義。

綜上所述，左、右半結腸癌在基因表達與生物信號通路兩個層面的差異，左半結腸癌可能與免疫功能異常、AMPK通路等生物過程相關，而右半結腸癌可能與中性粒細胞外陷阱形成、酒精中毒、Hippo通路等生物過程相關。除調控細胞周期及必需氨基酸代謝等機制外，苦參-大血藤-半枝蓮藥對治療左半結腸癌具有調節腸道內分泌功能的特異性作用，對右半結腸癌的炎癥反應具有特異性治療作用，且可能對結腸癌患者具有情緒調控作用。相關研究有待進一步開展。