基于轉錄組測序的煤工塵肺大鼠模型中線粒體相關差異基因篩選及分析

劉道偉， 張 娜， 劉琭璐， 章 梅， 楊惠芳

（1.寧夏醫科大學公共衛生學院，銀川 750004； 2.寧夏環境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004）

塵肺病是在職業活動中長期吸入不同致病性的生產性粉塵，并在肺內潴留而引起的，以肺組織彌漫性纖維化為主的一組職業性肺部疾病的統稱[1]。目前，塵肺病是我國發病人數最多、危害最嚴重的職業病，包括矽肺和煤工塵肺[2]。雖然近幾年我國塵肺病的新發病例數呈下降趨勢，但塵肺病給我國職業人群造成的危害仍然不可忽視[3]。在塵肺發病機制的復雜炎性網絡中，線粒體的致病作用越來越受到大家的重視。線粒體是細胞內氧化磷酸化的場所，為細胞生命活動提供能量、生成ATP 的同時，生成副產物活性氧，還具有調節細胞凋亡、內容物致炎等多種作用[4]。因此，粉塵引起的肺組織線粒體功能障礙可能是塵肺纖維化的重要發病機制之一。本研究擬在建立大鼠塵肺纖維化模型的前提下，利用轉錄組測序技術篩選出塵肺病發生和發展過程中與線粒體有關的重要基因，并進行生物信息學分析，以期為后續研究塵肺病的分子機制提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級7～8 周齡雄性SD 大鼠30 只，體質量200～220 g，購自寧夏醫科大學實驗動物中心。實驗動物飼養于（25±2）℃，空氣濕度50%～60%，12 h 明暗交替環境中，自由飲水、攝食，統一進食標準，適應性飼養1 周后開始進行實驗。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

1.2 材料和試劑

煤塵（寧夏煤礦礦井內回風巷降塵）；二氧化硅標準品（美國Sigma-Aldrich 公司）；乙醚（東莞市化學試劑有限公司）；4%多聚甲醛（蘭杰科技有限公司）；蘇木素（北京索萊寶科技有限公司）；伊紅（北京索萊寶科技有限公司）；Wiegert 鐵蘇木素（上海雙簡生物科技有限公司）；麗春紅酸性品紅（上海士鋒生物科技有限公司）；磷鉬酸［阿拉丁試劑（上海）有限公司］；苯胺藍（南京化學試劑股份有限公司）；辣根過氧化物酶標記鏈霉菌抗生物素蛋白溶液（杭州紐龍生物科技有限公司）；DAB 染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 主要儀器

石蠟切片機、低溫高速離心機（德國Rjung Heidelberg 公司）；潔凈工作臺（力康生物醫療科技控股有限公司）；精密電子天平（寧波金諾天平儀器有限公司）。

1.4 粉塵懸溶液制備

為配制懸濁液50 mg·mL-1，分別稱取1.75 g二氧化硅與煤塵于兩支50 mL 玻璃瓶中，再各加入生理鹽水35 mL，充分混勻，封口后在121 ℃高壓蒸汽鍋內消毒20 min，4 ℃保存備用。

1.5 分組和造模

根據隨機數表法將大鼠分為3 組，即對照組、煤塵組、矽塵組，每組10 只。采用一次性非氣管暴露法對煤塵組與矽塵組大鼠于氣管內分別注入1 mL 已配制好的煤塵和二氧化硅粉塵懸液，對照組以等量的滅菌生理鹽水代替。

1.6 肺組織病理學檢查

大鼠造模完成后于同一環境下飼養至90 d，乙醚麻醉后，心尖采血處死。迅速取出完整的肺組織，觀察大體形態并拍照。取左肺葉置于甲醛中，用于常規脫水、石蠟包埋、切片，分別進行HE染色和Masson 染色，通過免疫組化檢測膠原蛋白Ⅰ（COL-Ⅰ）表達水平。將右肺葉保存于液氮中，用于轉錄組測序實驗。

1.7 高通量測序

1.7.1 轉錄組測序步驟 對大鼠右肺葉樣本進行總RNA 提取與質檢，經mRNA 富集、雙鏈cDNA 合成、PCR 富集與文庫純化與庫檢后，開展高通量Illumina 測序分析。測序部分委托北京百邁客生物科技有限公司完成。使用Illumina HiSeq平臺對cDNA 文庫進行測序得到大量raw reads，過濾后得到原始數據（clean date），與參考基因組比對，得到mapped data。

1.7.2 基因功能分析與差異表達基因篩選 測序得到各組樣本的校正基因表達量后，進行基因的差異表達定量分析。對對照組與煤塵組、對照組與矽塵組兩兩進行分析，基因差異表達顯著水平與倍數，使用FDR（false discovery rate）進行可信度檢驗。在差異表達基因檢測過程中，將（上、下調差異倍數≥1.5）且FDR＜0.05 作為篩選標準。根據基因在不同樣品中的表達量進行差異表達分析、差異表達基因功能注釋和功能富集等表達水平分析。

1.8 統計學方法

數據采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD－t法。P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學觀察

通過對各組肺組織形態、肺組織切片染色（HE 染色、Masson 染色）和免疫組化COL-Ⅰ表達水平的觀察，發現煤塵組與矽塵組病理改變明顯且纖維化程度升高，出現了肺纖維化的典型特征，見圖1 至圖4。

圖1 大鼠肺組織形態學

圖2 大鼠肺組織HE 染色

圖3 大鼠肺組織Masson 染色

圖4 大鼠肺組織免疫組化實驗

2.2 序列比對分析

將質量控制后的clean reads 與參考基因組比對，12 個樣本比對到參考基因組上的reads 數目及在clean reads 中超過93.91%；比對到參考基因組唯一位置的reads 數目及在clean reads 中超過86.29%；比對到參考基因組多處位置的reads 數目及在clean reads 中低于8.11%。結果表明，轉錄組測序的結果具有較高的覆蓋度和均勻性。

2.3 基因的差異表達分析

在對照組與煤塵組中，1 246 個基因存在顯著性差異（上調913 個和下調333 個）；在對照組與矽塵組中，5 462 個基因存在顯著性差異（上調2 796 個和下調2 666 個），見圖5。根據測序數據中的FPKM 值生成差異基因火山圖和聚類熱圖，見圖6。

圖5 差異表達基因圖

2.4 GO 與KEGG 富集分析

對對照組與煤塵組、對照組與矽塵組樣本進行GO 富集分析，得到差異基因在GO term 上的分布情況，包括分子功能、生物過程、細胞組分。

對照組與煤塵組、對照組與矽塵組的差異基因均主要集中于生物調節、刺激反應、催化活性、細胞部分、單一的生物過程、細胞等功能上。對照組與煤塵組的差異基因富集在前20 條通路上，其中在類風濕關節炎、吞噬體、結核、細胞因子-細胞因子受體相互作用等顯著通路富集的差異基因最多。對照組與矽塵組的差異基因富集在前20條通路上，其中在癌癥的途徑、吞噬體、朊病毒病、結核等顯著通路富集的差異基因最多，見圖7。

圖7 差異基因GO 注釋分析和KEGG 富集分析

2.5 與線粒體有關的差異基因

對對照組與煤塵組中的差異基因進行篩選，與線粒體有關的差異基因Bcl2a1、Scimp、Arg2、Mmp9、Sod2 等，共35 個（28 個上調，7 個下調），對照組與煤塵組中相關差異基因較少。

對照組與矽塵組相比，和線粒體有關的差異基因Mmp9、Trem2、Akr1b8、Acod1、Ptcd3 等一共302 個（202 個上調，100 個下調）。通過GO 富集分析發現，在生物過程中，細胞過程、單一的有機體過程較為重要。在細胞組分中，以細胞部分、細胞為主。在分子功能中，以催化活性、活動分子傳感器為主。在對照組與矽塵組中，與線粒體相關的差異基因通過KEGG 顯著富集到的前20 條通路，包括精氨酸生物合成、丙酮酸代謝、軍團菌病、細胞凋亡、檸檬酸循環（TCA 循環）、氧代羧酸代謝、心肌收縮、p53 信號通路、氨基酸的生物合成、朊病毒病、細胞凋亡、逆行內源性大麻素信號、碳代謝、非酒精性脂肪肝病、氧化磷酸化、帕金森綜合征、亨廷頓病、產熱、阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化。其中，氧化磷酸化、產熱、帕金森綜合征、朊病毒病等通路富集的與線粒體相關的差異基因最多，見圖8。

圖8 與線粒體相關差異基因GO 注釋分析和KEGG 富集分析

3 討論

煤工塵肺的發生、發展是一個復雜的過程，從單一基因或單一通路探究疾病的發生和發展因素、尋求治療靶點是片面且困難的，所以篩選分析差異表達基因十分重要[5]。

本研究采用一次性非暴露式氣管內灌注法對大鼠進行染塵實驗，成功建立大鼠肺組織纖維化模型。通過肺組織形態學觀察與HE 染色、Masson 染色等觀察，確立大鼠纖維化病理切片特征。結果顯示，與對照組相比，煤塵組大鼠的肺組織表面觀察到大量煤斑，呈灶狀、境界不清、色黑、質軟，存在少量陳舊性的出血點；HE 染色切片中正常固有結構消失，大部分的肺泡間隔消失，肺間質鏡下充滿纖維化增生，有毛細血管擴張充血，炎性細胞浸潤于肺泡中，有的肺泡腔內充滿被煤塵侵蝕的細胞，煤斑增大融合，局部氣腔擴大。矽塵組大鼠的肺組織表面可見彌漫性粟粒狀結節，結節隆起于肺表面，質地較硬，肺表面有囊腫，并有融合病灶、散在陳舊性出血點；HE染色切片觀察到典型的矽結節由已發生玻璃樣變的膠原纖維構成，肺固有結構消失，肺泡結構不存在，肺組織內可見彌漫性纖維化病灶。Masson 染色切片中，煤塵組、矽肺組的膠原纖維程度均高于對照組。通過免疫組化對大鼠肺組織切片進行COL-Ⅰ表達水平的測定顯示，煤塵組、矽肺組的COL-Ⅰ表達水平均高于對照組。

高通量轉錄組測序技術在挖掘差異表達基因、揭示生物基因表達及調控機制中發揮了重要作用[6-7]。通過高通量轉錄組測序方式篩選出3 組大鼠的肺組織樣本的差異表達基因，并從中找出與線粒體有關的差異表達基因進行生物信息學分析。通過GO 富集分析發現煤塵組和矽塵組分別與對照組相比，在生物過程中，以細胞過程、單一的有機體過程較為重要；在分子功能中，以活動分子傳感器、催化活性為主；在細胞組分中，以細胞部分、細胞為主。

KEGG 代謝通路注釋結果表明，對照組與矽塵組中與線粒體相關的差異基因富集到的通路中，氧化磷酸化、產熱、帕金森綜合征、朊病毒病等通路富集的基因最多。煤工塵肺中與線粒體相關的差異基因，如Mmp9，有研究結果[8]表明，Mmp9 是一種新的線粒體功能障礙生物標志物，同時能激活生長因子，促進上皮下成纖維細胞增殖和活化，導致膠原纖維大量增生。

綜上所述，本研究通過轉錄組測序技術篩選出煤工塵肺中與線粒體相關差異基因和通路，這些差異基因可能成為煤工塵肺的基因治療靶點，為進一步解析探索煤工塵肺與線粒體的關系提供依據。