自然周期卵泡早排的預測及提前取卵價值評估

徐嗣亮，夏心如，蔣春艷，錢易，李梅，馬翔，刁飛揚，劉嘉茵，高彥

(南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心,南京 210029)

卵巢儲備功能減退(diminished ovarian reserve,DOR)會導致女性生育能力下降,行體外受精或卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)助孕是常見的治療方案。相較于控制性卵巢刺激(controlled ovarian stimulation,COS)的常規促排卵方案,自然周期具有可多周期連續取卵、新鮮周期可移植、縮短受孕等待時間等優勢,每移植周期臨床妊娠率與常規誘導排卵方案相似,卻極大的減輕了患者的經濟負擔,對DOR、常規COS卵巢反應不良或不宜常規COS的患者(比如卵巢交界性腫瘤或免疫系統疾病患者),自然周期是一個值得推薦的方案[1-2]。然而,自然周期的卵泡生長規律較難掌握,卵母細胞提早排逸現象較為普遍,周期取消率較高。因此,自然周期中對卵泡的監測、扳機和取卵時機的把握值得深入研究。

本研究選取2020年1月至2023年4月期間在南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心接受自然周期方案IVF/ICSI助孕的815名DOR患者,收集其臨床資料進行回顧性研究,探究DOR患者采用自然周期助孕中影響卵母細胞提前排逸的因素,并進一步比較采用自然周期的DOR患者扳機后提前及正常取卵的治療結局,從而評估提前取卵是否可以使有卵母細胞早排高風險的人群獲益。

資料與方法

一、研究對象及分組

本研究采用回顧性隊列研究的方法,分析2020年1月至2023年4月期間在本中心接受IVF/ICSI-ET助孕的815名DOR患者的臨床資料。

納入標準:(1) 符合博洛尼亞標準(Bologna Criteria):既往常規促排卵卵巢低反應(≤3個卵母細胞);竇卵泡數(AFC)<5～7個或抗苗勒管激素(AMH)<0.5～1.1 ng/ml;年齡>40歲,或存在其它損傷卵巢功能的危險因素,如卵巢手術、遺傳缺陷、放化療、自身免疫性疾病等。以上3條中有2條即為卵巢功能減退;(2)采用自然周期方案;(3)均有卵泡發育。

排除標準:(1) 夫妻雙方任一方染色體異常;(2)夫妻雙方任一方患嚴重內外科疾病;(3) 宮腔重度粘連及子宮畸形;(4)卵泡生長和雌激素水平不匹配,周期取消者。

根據取卵日卵母細胞是否提前排逸分為A、B兩組:A組為取卵日卵母細胞未早排組(712個周期),B組為取卵日卵母細胞早排組(103個周期)。再根據扳機后取卵時間將A、B兩組細分:扳機日血LH<20 U/L時扳機后36 h取卵,即A1(n=608)和B1組(n=90),若扳機日血LH≥20 U/L時扳機后24 h取卵,即A2(n=104)和B2組(n=13)。

二、研究方法

1.卵泡監測及扳機時機:所有DOR患者在月經第3天,經陰道B超檢測雙側卵巢的竇卵泡大小和數量,同時檢測血清基礎卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)及雌二醇(E2)水平。當卵泡直徑>14 mm時,開始監測血LH、E2、孕激素(P)水平。當優勢卵泡直徑>15 mm且每個優勢卵泡E2水平達到800～1 100 pmol/L時皮下注射0.1 mg促性腺激素釋放激素激動劑(達菲林;益普生,法國)或6 500 U重組人絨促性素(艾澤;默克,意大利)扳機,扳機日起每晚使用消炎痛栓100 mg納肛至取卵日。

2.取卵:扳機日血LH<20 U/L時,于當天20:00給予皮下注射0.1 mg促性腺激素釋放激素激動劑(達菲林)或6 500 U重組人絨促性素(艾澤)誘發排卵,注射后36 h取卵;若扳機日血LH≥20 U/L,則當天12:00扳機,注射后24 h取卵。取卵時用19G單腔針(COOK公司,澳大利亞),反復沖洗≤6次。

3.胚胎評分:授精17～18 h后觀察到兩個原核(2PN)及兩個極體(2PB)即為正常受精,按照Veeck卵裂期胚胎評分標準,依據授精72 h后胚胎的卵裂球數目、細胞質均一性、發育速度及碎片率等進行分級。其中卵裂球數目≥7個、碎片≤10%的胚胎為優質胚胎;卵裂球數目≥4個、碎片≤15%的胚胎為Ⅲ級以上可移植胚胎;卵裂球數目<4個、碎片>15%的胚胎為Ⅳ級廢棄胚胎。囊胚評分采用Gardner評分系統,4CC以上的囊胚認為是可利用囊胚,4BB以上的囊胚為優質囊胚。所用培養液均由美國Cook公司提供。

4.胚胎移植及黃體支持:自然周期多進行新鮮周期移植。若扳機日內膜厚度≥8 mm 且分型為A型或A-B型,則受精后第3天進行胚胎移植或培養至第5天進行囊胚移植;內膜厚度在6～8 mm 時,口服戊酸雌二醇(補佳樂;拜耳醫藥,德國)至內膜厚度達 8 mm 以上;若內膜厚度過薄(<6 mm)時,則胚胎進行玻璃化冷凍保存,然后等待下一周期的凍融胚胎移植(FET)。移植后常規地屈孕酮片(達芙通;蘇威制藥,荷蘭)20 mg/d口服和/或黃體酮軟膠囊(安琪坦;CyndeaPharma,西班牙)200 mg bid陰道用藥進行黃體支持。注:本研究中新鮮周期移植的胚胎僅為本周期取卵后培養形成的胚胎,FET 周期僅移植單次取卵周期獲得的胚胎,無多周期胚胎混合移植,且移植周期均為單胚胎移植。

5.妊娠結局判定:移植14 d后監測血清人絨毛膜促性腺激素(β-HCG),若β-HCG>5 U/L 繼續黃體支持;移植30 d后B超檢查宮內見孕囊及心管搏動,可確定臨床妊娠,黃體支持至妊娠10周逐漸減藥,妊娠12～13周停藥。

6.觀察指標:正常受精率(出現2PN 及2PB卵母細胞數/獲卵數×100%)、卵裂率(2PN卵裂數/2PN數×100%)、胚胎形成率(胚胎形成個數/2PN卵裂數×100%)、囊胚形成率(囊胚形成個數/行囊胚培養的胚胎數×100%)、優質胚胎率(優質胚胎數/可移植胚胎數×100%)、無可移植胚胎周期率[(未獲卵+未授精+未受精+未卵裂+無可移植胚胎周期)/取卵周期數×100%]、全胚冷凍率(全部胚胎冷凍周期/獲可移植胚胎周期數×100%)、鮮胚移植率(取卵周期移植胚胎周期數/獲可移植胚胎周期數×100%)、未獲卵率(1-穿刺獲得的卵母細胞數/穿刺的卵泡數)、HCG陽性率(HCG陽性周期數/移植周期數×100%)、臨床妊娠率(臨床妊娠周期數/移植周期數×100%)、流產率(流產周期數/臨床妊娠周期數×100%)、異位妊娠率(異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%)、活產率(活嬰出生周期數/移植周期數×100%)、早產率(孕37周前活嬰出生周期數/活產周期數×100%)、多胎率(多胎妊娠周期數/活產周期數×100%)、低體重兒出生率(出生體重小于2 500 g活產嬰兒周期數/活產周期數×100%)、巨大兒出生率(出生體重大于4 000 g 活產嬰兒周期數/活產周期數×100%)、累積活產率(新鮮周期+凍融周期移植獲得活產的周期數/取卵周期數×100%),累積臨床妊娠率(新鮮周期+凍融周期移植獲得臨床妊娠的周期數/取卵周期數×100%)。

三、統計學分析

結 果

一、患者一般情況比較

本研究共納入815個自然周期IVF/ICSI-ET治療周期,各組間患者年齡、BMI、AMH、基礎FSH水平及月經周期天數的差異均無統計學意義(P均>0.05)(表1)。

表1 患者一般情況比較[(-±s),M(P25,P75)]

二、相同取卵時間下早排組與非早排組患者的促排卵情況

扳機36 h后取卵的患者,取卵日卵母細胞未早排組(A1組)與取卵日卵母細胞早排(B1組)組相比,取卵周期起始第3天的最大卵泡直徑和激素(FSH、LH、E2)水平以及扳機藥物種類差異均無統計學意義(P均>0.05);A1組患者扳機日每個卵泡E2水平、LH水平及P水平均顯著低于B1組(P均<0.05)(表2)。

表2 扳機36 h后取卵的早排和非早排患者的促排卵情況比較[(-±s),M(P25,P75)]

扳機24 h后取卵的患者,A2組(取卵日卵母細胞未早排)與B2組(取卵日卵母細胞早排)相比,當取卵周期第3天的最大卵泡直徑和激素(FSH、LH、E2)水平以及扳機藥物種類差異均無統計學意義(P均>0.05);A2組患者扳機日每個卵泡E2、LH及P水平均較 B2組為低,但差異尚沒有統計學意義(P均>0.05)(表3)。

表3 扳機24 h后取卵的早排和非早排患者的促排卵情況比較[(-±s),M(P25,P75)]

三、扳機日LH水平對自然周期卵母細胞早排的預測價值

由于扳機日患者的激素水平不同,應用ROC曲線評價扳機日LH及P水平對預測自然周期卵母細胞早排的價值。統計結果發現:扳機日LH水平預測早排的ROC曲線下面積(AUC)為0.714[95%CI(0.668,0.760)],截斷值為13.745 U/L,對應的敏感性82.40%,特異性59.30%,約登指數為0.417;扳機日P水平預測早排AUC為0.580[95%CI(0.519,0.640)]截斷值為2.71 nmol/L,對應敏感性為29.3%,特異度為85.9%,約登指數為0.141。ROC曲線分析結果顯示,扳機日LH水平對卵母細胞早排有一定預測價值,而扳機日P水平的預測價值欠佳。

四、卵母細胞未早排的正常取卵與提前取卵組間臨床數據、妊娠結局及分娩結局比較

卵母細胞早排組由于在取卵日當天卵母細胞已經排出,B組患者沒有取卵,故沒有相應的臨床妊娠情況及分娩情況。統計比較卵母細胞未早排的患者的相關數據顯示:扳機后36 h正常取卵的A1組患者,其扳機日LH及P水平顯著低于24 h提前取卵的A2組,而A1組患者的受精率、卵裂率均顯著高于A2組(P<0.05),A2組的無可移植胚胎率高于A1組,而兩組間的未獲卵率、胚胎形成率、優質胚胎率、囊胚形成率、優質囊胚率、全胚冷凍率、鮮胚移植率差異無統計學意義(P均>0.05)(表4)。

表4 卵母細胞未早排DOR患者不同時間取卵組間的受精及胚胎培養結局比較[(-±s),%]

新鮮周期中,A1、A2兩組間的HCG陽性率、臨床妊娠率、流產率、活產率差異均無統計學意義(P>0.05);其中,受樣本量所限,A2組異位妊娠率、早產率、巨大兒出生率、低體重兒出生率為0(表5)。進一步計算累積妊娠結局發現,A1組的累積HCG陽性率、累積臨床妊娠率、累積活產率均顯著高于A2組,差異有統計學意義(P<0.05)(表6)。

表5 卵母細胞未早排DOR患者不同時間取卵組間的胚胎移植情況比較(%)

表6 卵母細胞未早排DOR患者不同時間取卵組間的累積妊娠結局比較(%)

獲卵后培養若形成可移植胚胎且內膜達標,則進行鮮胚移植。本研究中,卵母細胞未早排兩組(A1、A2)中共有255個周期進行了鮮胚移植,其中46個周期獲得臨床妊娠,其余209個周期未獲臨床妊娠。分組比較后發現臨床妊娠組患者的年齡顯著低于未臨床妊娠組(P<0.001),而兩組患者間的AMH、BMI、扳機日E2、P、LH水平、提前取卵周期的占比以及移植優質囊胚率,差異均無統計學意義(P均>0.05),雖然臨床妊娠組的移植優質卵裂胚率、移植囊胚率較未臨床妊娠組為高,但差異尚未達統計學意義(P均>0.05)(表7)。

表7 卵母細胞未早排患者鮮胚移植周期臨床數據比較[(-±s),M(P25,P75),%]

討 論

1978年,世界首例“試管嬰兒”通過自然周期體外受精(natural cycle in vitro fertilization,NC-IVF)技術成功妊娠分娩。但自然周期每取卵周期僅能獲得1枚卵母細胞。隨著促排卵方式的出現,使每取卵周期可獲得多個卵母細胞,進而形成多枚胚胎,從而提高了輔助生殖技術助孕的成功率。但是,大劑量促性腺激素刺激的過程造成非生理狀態的高雌、孕激素環境,不僅明顯增加了卵巢過度刺激綜合征等促排卵并發癥的風險,還具有溶黃體毒性[3];同時,過量募集卵泡增加耗氧量,在一定程度上打破了卵巢的氧化應激平衡,促使卵母細胞減數分裂、發育潛能和表觀遺傳修飾異常,核胞漿成熟不同步,導致受精異常、胚胎非整倍體率升高,流產率增加,顯著增加了產科不良生育結局[4]。促排卵中高劑量促性腺激素對高齡DOR患者影響尤甚[5-6]。近年來,越來越多的學者提出對DOR患者采用自然周期方案,以減少卵泡發育過程中氧化自由基的產生,通過無干擾的自然選擇,募集周期中最優質的卵母細胞,以期提高所獲卵母細胞的質量[1]。自然周期雖然取消率高,但因其更接近生理狀態,一旦獲得可移植胚胎,其移植后的妊娠率及活產率均高于常規誘導排卵周期,早產兒及低出生體質量兒率均明顯下降,產科結局明顯改善[7]。同時,自然周期方案可多周期連續取卵,并發癥風險低,且監測簡單、減少了患者的痛苦和經濟負擔。對于高齡DOR、既往多次誘導排卵卵巢低反應或因罹患免疫系統疾病、卵巢交界性腫瘤而不適宜常規誘導排卵的患者,自然周期取卵是一種有前景的治療方法[8-9]。然而,自然周期的卵泡生長規律較難掌握,LH峰提前出現增加了卵母細胞提早排出的風險,導致自然周期取消率高[10-11]。探尋預測卵母細胞在取卵前早排的臨床指標,可以成為預防卵母細胞早排和規劃取卵時間的重要依據[12-13]。

隨著卵泡直徑增大,卵泡顆粒細胞分泌的E2增多,卵泡成熟時形成的E2峰正反饋刺激垂體分泌LH,內源性LH峰誘發排卵及卵泡黃素化,P隨之升高。LH的升高預示卵母細胞提前排逸的可能,是臨床上極為關注的節點[14-15]。我中心既往研究數據顯示,自然周期LH≥20 U/L時,卵母細胞取卵前提早排出率達26.09%;當LH≥30 U/L時,卵母細胞取卵前提早排出率高達72.73%[12]。本研究運用ROC曲線分析再次證實了扳機日LH水平對卵母細胞早排有較好的預測價值,并提示當LH≥13.745 U/L時就需要警惕卵母細胞提前排逸的發生。雖然經ROC曲線分析,扳機日P水平對預測卵母細胞早排的敏感性及特異性欠佳,但P水平的增高會通過改變子宮內膜基因的表觀遺傳修飾、黏附因子表達及免疫狀態損害子宮內膜容受性,引起子宮內膜窗口期提前,最終降低ART鮮胚移植的妊娠率、增加流產率[16-17]。本研究發現,采用自然周期方案助孕的高齡DOR患者,未獲臨床妊娠組患者的扳機日P水平雖高于臨床妊娠組,但差異沒有統計學意義(P>0.05),而臨床妊娠組患者的年齡顯著低于未獲臨床妊娠組(P<0.05)。同時,提前取卵的未早排組,雖然扳機日LH及P水平均顯著高于正常取卵的未早排組,但兩組的鮮胚移植周期的HCG陽性率、臨床妊娠率、流產率、活產率差異均無統計學意義(P>0.05),以上結果均提示相較于扳機日P水平,年齡才是高齡DOR患者鮮胚移植周期臨床妊娠率的絕對影響因素。后期需要進一步擴大樣本量評估扳機日不同P水平對卵母細胞早排及后續鮮胚移植結局的影響,探尋更有臨床應用價值的預測指標。

與扳機日LH、P水平升高而進行搶救性取卵相比,我們更希望在扳機日之前,特別是在周期的起始階段就能夠預測本周期卵母細胞早排的風險。本研究發現取卵日卵母細胞早排與患者年齡、BMI、基礎FSH值、月經周期天數無關。本研究將取卵周期第三天(即本取卵周期起始狀態下)的卵泡大小、FSH、LH、E2水平納入研究,仍沒有發現取卵周期初始階段上述指標對卵母細胞早排具有預測價值。因此,在自然周期取卵當月的啟始階段,尚缺乏有效的預測指標可以預測卵母細胞提前排逸的風險。優勢卵泡形成后監測激素水平仍然是判斷卵母細胞早排的可靠指標。在臨床上,扳機日出現LH、P水平過高者,可采用GnRH拮抗劑或者非甾體類抗炎藥(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs,NSAIDs)預防卵母細胞早排,同時可以提前取卵來降低周期取消的風險[18-20]。

本研究進一步比較了提前取卵與正常取卵人群的獲卵情況、胚胎結局及妊娠結局后發現,雖然2組間的未獲卵率、胚胎形成率、優質胚胎率、囊胚形成率、優質囊胚率、鮮胚移植率、全胚冷凍率的差異均無統計學意義(P均>0.05),但是因為扳機日LH水平升高從而提前取卵的患者的受精率及卵裂率顯著降低,無可移植胚胎率顯著升高,且正常取卵組累積HCG陽性率、累積臨床妊娠率、累積活產率均高于提前取卵組(P均<0.05)。在本研究中,提前取卵人群臨床結局不理想,可能與LH峰提前出現,卵母細胞胞質及胞核成熟不同步導致有效胚胎率下降有關[15,21]。本研究結果提示在臨床上應盡量避免提前取卵。對于扳機日激素水平提示卵母細胞可能提前排逸的人群,為了防止卵母細胞早排而提前取卵可能并不能顯著改善臨床結局,反而加重了患者的經濟負擔和心理壓力。

綜上所述,自然周期方案對于高齡DOR患者是一種有效、合理、低成本、低風險的助孕方式。但自然周期中內源性LH峰值的出現時機難以預測,個體差異較大,缺乏準確的參考標準,給臨床工作帶來不便。對于扳機日LH、P升高,有卵母細胞提前排逸可能的高風險人群,提前取卵并不能顯著改善患者的助孕結局。對于不存在男方因素,輸卵管通暢,可正常排卵的人群,如果在卵母細胞成熟時出現了早發LH峰及P升高,可以指導患者試孕;對于存在輸卵管或男方因素,或因無卵泡發育反復取消周期、卵母細胞極其珍貴的患者,也可以選擇扳機后提前取卵,以增加獲卵機會。在取卵前使用GnRH拮抗劑或NSAIDs以抑制卵母細胞早排、降低周期取消率;對于無自然受孕可能的人群,如果排卵后存在3枚及以上直徑小于8 mm的竇卵泡,可以酌情選擇黃體期促排卵以增加獲卵數目。需要注意的是,本研究由于納入病例數有限,且為回顧性研究,難以完全避免數據偏倚對研究結果的干擾,還需要多中心、隨機對照試驗進一步證實觀點的有效性。在未來的研究和工作中,需要通過細致的觀察和摸索,尋找有效預測卵母細胞提前排逸的因素,準確把握LH峰值出現的前兆,盡量避免不成熟卵母細胞的提早排出及非必要的提前取卵,提高卵母細胞成熟度和優質胚胎率,最終改善臨床妊娠結局。