芩蓮正積方水提物中總黃酮提取工藝的優化*

孫 瑤，蘇 適，陳洪玉，張曉萌，閻力君

（哈爾濱商業大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

芩蓮正積方由黃芩、半枝蓮、清半夏、莪術、重樓、浙貝母、薏苡仁、厚樸、陳皮和甘草10 味中藥組成，具有扶正祛邪的功效，能抑制肺癌轉移，在臨床上對非小細胞肺癌患者有良好的治療作用[1-4]。研究表明，芩蓮正積方中的有效成分黃酮類化合物能發揮重要的抗腫瘤作用，能阻滯NSCLC 細胞增殖，抑制EMT 和血管生成，抑制NSCLC 的生長和轉移，促進NSCLC 細胞凋亡等[5-7]。中藥材的溶劑提取法在多種提取方法中應用廣泛，根據相似相溶原理，溶劑進入藥材內部，通過解除組織吸附作用而提高有效成分的濃度，增加滲透壓，形成細胞內外滲透壓差，破壞植物細胞壁而加快內容物流出，能夠有效提取化合物[8]。黃酮類化合物的提取方法廣泛，包括水提法、回流-酶法和超聲-酶法、超聲波提取和微波提取等[9-11]。水提法是傳統的中藥提取方法，具有操作簡單、提取方便和成本低等優點，能夠有效地提取黃酮類化合物[12]。因此，本實驗采用水提法提取芩蓮正積方，以方中總黃酮提取率為指標，經由單因素實驗和正交實驗優化提取工藝，為芩蓮正積方更好的發揮療效奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

黃芩、半枝蓮、清半夏、莪術、重樓、浙貝母、厚樸、薏苡仁、陳皮和甘草，均購自黑龍江省哈爾濱市三棵樹藥材市場。

NaNO2（AR 純度99% 天津市天力化學試劑有限公司）；Al（NO3）3（AR 純度99% 天津市福晨化學試劑廠）；NaOH（AR 純度96% 天津市天力化學試劑有限公司）；無水乙醇（純度100% 中國科學院成都生物研究所）；蒸餾水（哈爾濱市南崗區實林蒸餾水經銷處）。

精密電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；XMTD-4000 型電熱恒溫水浴鍋（海申盛生物技術有限公司）；SE-750 型高速多功能粉碎機（永康市圣象電器有限公司）；Re-52AA 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環水式多功能真空泵（鞏義市瑞德儀器設備有限公司）；L550 型臺式低速大容量離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；T6 新世紀型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 取適量黃芩、半枝蓮、清半夏、莪術、重樓、浙貝母、厚樸、薏苡仁、陳皮、甘草于高速多功能粉碎機進行粉碎，過篩后收集到自封袋中備用。

1.2.2 溶液的制備

5%NaNO2溶液 稱取NaNO210.00g，用蒸餾水溶解后定容至200mL。

10%Al（NO3）3溶液 稱取Al（NO3）320.00g，用蒸餾水溶解后定容至200mL。

4%NaOH 溶液 稱取NaOH 8.00g，用蒸餾水溶解后定容至200mL。

60%乙醇溶液 量取無水乙醇600mL，用蒸餾水定容至1000mL。

蘆丁標準品溶液（0.1mg·mL-1）稱取蘆丁10.00mg，加無水乙醇溶解，然后用60%的乙醇溶液定容至100mL，搖勻。

供試品溶液（1mg·mL-1）稱取芩蓮正積方水提物粉末5.00mg，用蒸餾水定容至5mL，搖勻。

1.2.3 標準曲線的繪制 量取蘆丁標準品溶液（0.1mg·mL-1）5 份，體積分別為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，轉移至10mL 容量瓶中，分別加入蒸餾水5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5mL，混合均勻后加入0.3mL的5%NaNO2溶液，靜置5min，然后加入0.3mL 的10%Al（NO3）3溶液，靜置6min，再加入2mL 的4%NaOH 溶液，蒸餾水定容至刻度線，混勻后靜置10min，以第一組為空白，于510nm 處測定吸光度，繪制標準曲線，以蘆丁的濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為：Y=11.189X-0.0012，R2=0.9993，方程的線性良好。

1.2.4 芩蓮正積方總黃酮提取率測定 精密稱取芩蓮正積方提取物粉末，按“1.2.2”項下步驟配制成0.2mg·mL-1的供試品溶液，按“1.2.3”項下步驟測定芩蓮正積方提取物供試品溶液的吸光度，得到芩蓮正積方提取物的總黃酮提取率。

表1 單因素實驗表Tab.1 Single factor experiment

1.2.5 單因素實驗

（1）浸泡時間的影響 將13.5g 芩蓮正積方總藥物粉末按照料液比1∶15 加入蒸餾水202.5mL，混合均勻，室溫下分別不浸泡、浸泡0.5、1、1.5、2h 后，置于80℃的水浴鍋中提取60min（提取1 次）。將提取的濾液在4000r·min-1條件下離心10min，上清液經布氏漏斗抽濾，旋轉蒸發儀濃縮藥液后，轉移至蒸發皿烘干，收集粉末備用。

（2）提取溫度的影響 將13.5g 芩蓮正積方總藥物粉末按照料液比1∶15 加入蒸餾水202.5mL，混合均勻，室溫下浸泡0.5h 后，分別置于60、70、80、90、100℃的水浴鍋中提取60min（提取1 次）。將提取的濾液在4000r·min-1下離心10min，上清液經布氏漏斗抽濾，旋轉蒸發儀濃縮藥液后，轉移至蒸發皿烘干，收集粉末備用。

（3）提取次數的影響 將13.5g 芩蓮正積方總藥物粉末按照料液比1∶15 加入蒸餾水202.5mL，混合均勻，室溫下浸泡0.5h 后，置于80℃的水浴鍋中提取60min，分別提取1、2、3、4、5 次。將提取的濾液在4000r·min-1下離心10min，上清液經布氏漏斗抽濾，旋轉蒸發儀濃縮藥液后，轉移至蒸發皿烘干，收集粉末備用。

（4）提取時間的影響 將13.5g 芩蓮正積方總藥物粉末按照料液比1∶15 加入蒸餾水202.5mL，混合均勻，室溫下浸泡0.5h 后，置于80℃的水浴鍋中分別提取30、60、90、120、150min（提取1 次）。將提取的濾液在4000r·min-1下離心10min，上清液經布氏漏斗抽濾，旋轉蒸發儀濃縮藥液后，轉移至蒸發皿烘干，收集粉末備用。

（5）料液比的影響 將13.5g 芩蓮正積方總藥物粉末分別按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入蒸餾水，混合均勻，室溫下浸泡0.5h 后，置于80℃的水浴鍋中提取60min（提取1 次）。將提取的濾液在4000r·min-1下離心10min，上清液經布氏漏斗抽濾，旋轉蒸發儀濃縮藥液后，轉移至蒸發皿烘干，收集粉末備用。

1.2.6 正交實驗 根據單因素實驗結果，以芩蓮正積方中總黃酮提取率為指標，篩選出3 個對總黃酮提取率影響較大的因素，設計三因素三水平的L9（33）正交實驗，正交實驗因素水平表見表2，正交實驗設計表見表3。

表2 正交實驗因素水平表Tab.2 Orthogonal experiment level factor table

表3 正交實驗設計表Tab.3 Orthogonal experiment design table

1.2.7 數據統計與分析 使用Graphpad Prism8.0軟件進行圖表制作，使用SPSS 25.0 軟件進行數據分析，數據以X±S 表示，兩組均數比較用T 檢驗，多組均數比較用單因素方差分析，P＜0.05 顯示有差異，具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 浸泡時間的影響（圖1）

圖1 不同浸泡時間對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of different soaking time on the extraction rate of flavonoids

由圖1 可見，延長藥材浸泡時間，并不能使芩蓮正積方中總黃酮提取率增加，反而呈現降低的趨勢，浸泡時間為0h 時，黃酮提取率最高，考慮到節約時間和成本的因素，為簡化提取工藝，故選擇無需浸泡進行后續實驗。

2.1.2 提取溫度的影響（圖2）

圖2 不同提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction temperatures on the extraction rate of flavonoids

由圖2 可見，隨著溫度的升高，能夠加快分子間的熱運動，有利于藥材細胞壁的破裂和溶劑滲入藥材而提高總黃酮的得率，在70～90℃范圍內黃酮提取率較高，提取溫度為80℃時，提取率最高，故選擇70、80、90℃進行正交實驗。

2.1.3 提取次數的影響（圖3）

圖3 不同提取次數對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different extraction times on the extraction rate of flavonoids

由圖3 可見，增加提取次數，并不能顯著改善芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率，由于此方中的藥材較多，提取出的有效成分也較多，方中半枝蓮、清半夏、浙貝母、厚樸、陳皮都含有生物堿成分，而黃酮類化合物多具酚羥基，顯酸性，可與堿類成分發生反應；有研究表明[13]，提取2 次時，生物堿提取率最高，故推測提取次數為2 次時，大部分黃酮與生物堿發生了反應；提取3～5 次時，黃酮提取率根據藥液中生物堿的量的減少有所回升。提取1 次得到的黃酮提取率最高，故選擇提取次數為1 次進行后續實驗。

2.1.4 提取時間的影響（圖4）

由圖4 可見，提取時間在30～60min 和90～120min兩個范圍內，芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率和提取時間成正比。提取時間在60～90min 和120～150min 兩個范圍，芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率和提取時間成反比。說明改變提取時間可以影響芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率，30～90min 比90～150min 黃酮提取率高，所以將提取時間作為正交實驗的一個考察因素，設置3 個水平為30、60、90min。

2.1.5 料液比的影響（圖5）

圖5 不同料液比對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of different ratio of material-liquid on extraction rate of flavonoids

由圖5 可見，當料液比為1∶15 時，黃酮提取率最高，料液比在1∶15～1∶30 范圍內，芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率和料液比成反比?？梢娏弦罕扔绊戃松徴e方提取物中總黃酮提取率，因此，將料液比作為正交實驗的一個考察因素，設置3 個水平為1∶10、1∶15、1∶20。

2.2 正交實驗結果

為了優化芩蓮正積方水提取黃酮的提取工藝，根據單因素實驗結果，按照L9（34）正交設計表進行實驗，考察提取溫度（A）、提取時間（B）和料液比（C）3 個因素的正交設計對芩蓮正積方中總黃酮提取率的影響，得到9 組正交實驗結果見表4，方差分析結果見表5。

表4 正交實驗結果Tab.4 Orthogonal experiment results

表5 方差分析Tab.5 Variance analysis

由表4 可知，R 值越大說明該因素對實驗結果的影響越大，比較3 個因素的R 值，對芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率影響大的因素依次為提取時間（B）＞料液比（C）＞提取溫度（A）。K 值越大說明該水平對實驗結果的影響越大；對于A 因素：K3＞K1＞K2；對于B 因素：K2＞K1＞K3；對于C 因素：K2＞K1＞K3。以上結果說明芩蓮正積方總黃酮的最佳提取工藝為A3B2C2，即浸泡時間0h、提取次數1 次、提取溫度90℃、提取時間60min、料液比1∶15，在該提取工藝下得到的芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率最高。

由表5 可見，提取時間（B）能夠顯著影響芩蓮正積方水提物中總黃酮提取率（P＜0.05），而提取溫度（A）和料液比（C）對芩蓮正積方水提物中總黃酮提取率沒有顯著影響。

2.3 最佳水提取工藝驗證實驗

在上述所得的最佳提取工藝條件下平行提取3次進行驗證，結果見表6。

表6 最佳工藝驗證（%）Tab.6 Optimum process verification

由表6 可見，芩蓮正積方總黃酮提取率為6.76%，RSD 為0.55%。說明此最佳工藝穩定且合理。

3 結論

芩蓮正積方臨床上通常采用水煎煮提取法，但由于提取溫度、提取時間、溶劑量、浸泡時間和提取次數等條件的變化均能導致中藥復方的黃酮提取率不同，因而使療效的發揮程度有異。本文通過單因素實驗和正交實驗，得到在浸泡時間0h、提取次數1次、提取溫度90℃、提取時間60min、料液比1∶15 的提取工藝條件下，芩蓮正積方水提物中總黃酮提取率最高，為6.76%。該結果為提高方中有效成分總黃酮的溶出提供了借鑒方法。