刺梨果渣阿拉伯木聚糖對α-淀粉酶的抑制及其酵解特征研究

郭銀萍,劉含,穆興燕,李桂丹,劉曉燕,2*

1(貴陽學院 食品與制藥工程學院,貴州 貴陽,550005)2(貴州省果品加工工程技術研究中心,貴州 貴陽,550005)

刺梨(RosaroxburghiiTratt,RRT)被譽為“維C之王”,既有藥用價值,又可食用,是一種具有保健和治療功能的營養珍果[1-2]。刺梨有多種藥理作用,如消炎、抗氧化、降血糖、降血脂、鎮靜等,具有一定的臨床應用潛力[3-4]。刺梨果榨汁后剩下的部分占其果實質量的50%左右,但大多數加工企業卻未能有效地利用,而是直接將其廢棄,造成了一定的資源浪費[5]。而在果渣中,有一種被認為是膳食纖維的多糖:阿拉伯木聚糖(arabinoxylan, AX)[6],它的分子結構由兩種葡萄糖苷單元組成,即β-D-木糖苷和α-L-阿拉伯糖苷。它們以β-(1→4)鍵連接成線性木聚糖骨架,其中一些取代基通過O-2和O-3原子與木聚糖殘基相連[7]。

AX具有許多生理功能和健康益處。包括可以增強免疫系統,降低疾病發生的可能性,減少肝臟器官損害,提高腸道中益生菌的數量等[8]。AX可以抵抗人類酶的消化,并依賴于微生物酶進行消化,腸道微生物會對AX進行發酵,從而產生能量,最終產物如短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs),主要是醋酸、丙酸和丁酸,這些產物對宿主的健康有深遠的影響[9]。多糖在降糖方面也有著廣泛研究,有研究表明其能通過競爭結合位點減緩α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶代謝、分解葡萄糖,顯示出良好的降糖藥效[10]。NIE等[11]研究表明,通過調節腸道微生態的平衡,AX能夠提高有益菌的數量,同時也能影響腸道的代謝物,從而緩解2型糖尿病的病理狀況?；诖?本文研究了刺梨果渣中AX的降糖活性與酵解特征,為刺梨果渣的高效利用以及在功能活性方面的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨果渣,貴州省龍里縣;木糖、α-淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、纖維素DEAE-52、Sephadex G-100、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶、L-半胱氨酸、地衣酚、粘液蛋白,上海源葉生物科技有限公司;乙酸、丙酸、己酸、丁酸、戊酸、異戊酸、異丁酸,Sigma-aldrich(上海)貿易有限公司;4-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷(4-nitrophenyl α-D-galactopyranoside,PNPG)、可溶性淀粉、阿拉伯半乳糖、三氯甲烷、正丁醇、醋酸鈉、苯酚、DNS顯色劑、乙醚,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

BILKON-FD5BD真空冷凍干燥機,上海比朗克儀器制造有限公司;Multiskan SkyHigh酶標儀、Thermo Trace 1300氣相色譜儀,ThermoFisher Scientific科技(中國)有限公司;HL-2恒流泵、BSZ-100全自動部分收集器,上海青浦滬西儀器廠;LC-20A高效液相色譜儀,日本島津公司;F-280熒光分光光度計,天津崗東科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 AX的提取

參考谷春梅等[12]和馬福敏等[13]的方法。實驗以刺梨果渣作為原材料,采用超聲輔助酶法提取刺梨果渣中AX,其中纖維素酶(50 u/mg)與木聚糖酶(6 000 u/mg)酶活力比1∶1,復合酶添加量30 mg、料液比為1∶20(g/mL)、超聲波溫度85 ℃、超聲波時間65 min、超聲波功率260 W。AX樣品提取率計算如公式(1)所示:

(1)

AX提取工藝如下:

刺梨果渣→酶處理→超聲→離心→醇沉→離心→冷凍干燥

1.2.2 AX的純化

參考姜玉瑩[14]和劉磊等[15]的方法,稍作修改。純化流程如下:

粗提物→脫蛋白→DEAE cellulose-52陰離子交換柱層析→Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析法→純化物

純度計算參考趙夢麗[16]的方法,稍作改動。采用地衣酚-鹽酸法測定AX純度。分別移取不同濃度木糖溶液3 mL,加入3 mL質量分數0.1% FeCl3溶液(用質量分數37%左右HCl溶解)和0.3 mL質量分數1%地衣酚(無水乙醇溶解)混勻,沸水浴30 min冷卻后,定容至10 mL,以OD值(A670nm-A580nm)和木糖含量繪制標準曲錢:y=0.001 4x+0.015 2,R2=0.992 3。

稱取0.1 g樣品加入2 mol/L HCl 20 mL,具塞試管于沸水浴中酸解120 min。冷卻后用濾紙過濾,收集濾液(可適當稀釋),吸取3 mL樣品液采用標曲測定方法測定其AX含量。計算如公式(2)所示:

(2)

式中:X,阿拉伯木聚糖含量,g/100 g;c,由標曲所得AX含量,μg;0.88,轉換系數;n,稀釋倍數;m,樣品干重,g。

1.2.3 AX的降糖活性

1.2.3.1 阿拉伯糖(arabinose,Ara)、木聚糖(xylan,Xyl)、AX與α-淀粉酶的分子對接模擬

從RCSB PDB下載α-淀粉酶(PDB ID:6M4K),平臺(https://pubchem.ncbi.nIm.nih.gov)下載Xyl(PubChem CID:129539666)、Ara(PubChem CID:439195)和AX(PubChem CID:405238652),隨后將小分子sdf格式用OpenBable軟件轉化為mol2格式。在Pymol軟件中打開蛋白質的大分子模型,移除水分子和原來的配體,把結果存成PDB格式的文檔備用。使用AutodockTools 1.5.6對大分子進行加氫、計算電荷、確定分子的剛性類型,保存為PDBQT格式備用。打開Pymol,導入對接好的文件,改變配體顏色以便于區分大分子,顯示氫鍵與氫鍵長度、顯示蛋白殘基棍狀結構與殘基名稱,隨后降低大分子顏色,可視化完成。

1.2.3.2 酶抑制活性測定

參考王閃[17]的方法,稍作修改。取不同質量濃度待測液(1、2、3、4、5 mg/mL)0.25 mL,加入α-淀粉酶(6 U/mL)溶液,37 ℃水浴10 min,加入0.5 mL質量分數1%淀粉溶液,恒溫5 min,加入1 mL DNS顯色劑,沸水浴5 min后,冷卻定容至10 mL,于520 nm處測A1,對照組用PBS代替待測液(A0),基數組用PBS代替底物(A2)。計算如公式(3)所示:

(3)

1.2.3.3 抑制動力學研究

參考林寶妹等[18]的方法,稍作修改。將1 mg/mL的α-淀粉酶配制成不同質量分數(0.2、0.4、0.6、0.8、1%),測定不同AX質量濃度(0.4、0.8、1.2、2 mg/mL)酶促反應速率,用Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖,判斷抑制類型。

1.2.3.4 熒光光譜分析

參考李瓊等[19]和ZHANG等[20]的方法,稍作修改。分別取0、10、20、40、60、80 μg/mL AX溶液與1 mg/mL淀粉酶溶液混合,18、37 ℃下水浴30 min,之后進行熒光光譜掃描。在激發波長為280 nm,狹縫寬度為5 nm條件下進行檢測。用Stern-Volmer方程表示熒光猝滅,如公式(4)所示:

(4)

式中:F0、F,α-淀粉酶與AX相互作用前后的熒光強度;[Q],AX質量濃度,mg/mL;τ0,熒光物質在無猝滅劑影響下的平均壽命,生物大分子的τ0值一般為10-8s;Kq,猝滅速率常數;KSV,Stern-Volmer猝滅常數。

1.2.4 體外模擬酵解

參考陳光靜[21]的方法,稍作修改。糞便樣本來自3名健康的志愿者(1名男性,2名女性,平均年齡為23.7)。他們必須滿足以下所有要求:1)至少3個月未服用任何抗生素;2)良好的飲食習慣;3)沒有消化系統疾病。將各糞便樣本按1∶1(質量比)的比例混合,并立即密封,保證為厭氧環境。在糞便樣本中加入無菌磷酸鹽緩沖鹽水(0.1 mol/L,pH值為7.2)。用消毒玻璃棒攪拌每種混合物5 min,然后通過2層粗棉布過濾。隨后,將0.005 g FeSO4·7H2O、0.08 g CaCl2、0.4 g膽汁酸、0.5 g K2HPO4、0.69 g MgSO4·H2O、0.8 gL-半胱氨酸、1 g瓜爾膠、1.5 g NaHCO3、2 g阿拉伯半乳糖、2 g果膠、3 g酪蛋白、4 g粘液蛋白、4.5 g KCl、4.5 g NaCl、4 mL重青素(質量分數0.025%)和1 mL Tween 80溶解在1 L去離子水中制備堿性培養基。將糞便漿液(質量分數10%)與發酵培養基(5 mg/mL的AX溶液)按1∶1(體積比)的比例混合成AX發酵組,在37 ℃厭氧條件下孵育24 h,其中空白對照組以無菌水替代。分別在0、3、6、12、18、24 h取樣,冷卻后,在4 ℃下保存20 min。然后收集上清液備用,測定每個時間段的pH值及SCFAs含量。

1.2.4.1 發酵液pH的測定

使用pH計測定空白組及AX發酵液的pH值。

1.2.4.2 發酵液中SCFAs的測定

色譜條件:Thermo Trace 1300氣相系統,色譜柱為Agilent HP-INNOWAX 毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣量1 μL,分流比10∶1。進樣口250 ℃;離子源300 ℃;傳輸線250 ℃。程序起始溫度90 ℃;以10 ℃/min升至120 ℃后,以5 ℃/min升至150 ℃;再以25 ℃/min升至250 ℃,維持2 min。氦氣載氣流速1.0 mL/min。

標準品配制:取乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸標準品配制成100 mg/mL的儲備液,稀釋儲備液得到6種酸的系列工作標準溶液;取己酸標準品適量用乙醚配制成100 mg/mL的儲備液,并用乙醚稀釋儲備液得到己酸系列工作標準溶液。內標(4-甲基戊酸)用乙醚配制成75 μg/mL,200 μL 6種酸的系列工作標準溶液、100 μL 15%磷酸、20 μL己酸系列工作標準溶液、20 μL內標和260 μL乙醚混合配制成0.02、0.1、0.5、1、2、5、10、25、50、100、250、500 μg/mL 12個標曲工作液。儲備液保存于-20 ℃備用。以標準品的濃度為橫坐標、峰面積比值為縱坐標得到的SCFAs的線性回歸方程見表1(相關系數R2>0.99)。

表1 短鏈脂肪酸線性回歸方程Table 1 Linear regression equation of SCFAs

樣品配制:取適量樣本于2 mL離心管中,加50 μL質量分數15%磷酸,再加75 μg/mL的內標(異己酸)溶液10 μL和乙醚140 μL勻漿1 min,于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清液上機測試。

1.3 數據處理

采用Execl、SPSS 26、Minitab 17和Design-Expert 12軟件對數據進行處理分析,采用Origin 2018制圖。

2 結果與分析

2.1 分子對接模擬結果

實驗采用復合酶法提取AX的得率為(4.31±0.07)%,地衣酚-鹽酸法測得刺梨果渣AX粗提物純度為25.60%,純化物純度為75.92%,實驗以純化后的AX原料進行降糖及酵解特征研究。其中分子對接結果表明,α-淀粉酶能與Ara、Xyl、AX結合(表2)。

表2 α-淀粉酶與Ara、Xyl、AX分子對接結果Table 2 α-Docking results of amylase with Ara, Xyl, AX

其中Ara與與α-淀粉酶結合性最好,結合能為-14.518 2 kJ/mol,有9條氫鍵,Ara共與α-淀粉酶3個殘基相連,分別是GLU-502、ASN-500和ARG-483。其中Xyl與α-淀粉酶結合性最低,結合能為-6.736 kJ/mol,共5條氫鍵,Xyl共與α-淀粉酶3個殘基相連,分別是GLU-461、PHE-511和ARG-437。α-淀粉酶與Ara、Xyl、AX殘基結合圖如圖1所示。

a-Ara;b-Xyl;c-AX

2.2 AX對α-淀粉酶的抑制活性

抑制α-淀粉酶的活性是探討降糖作用機制的有效手段之一,而模擬分子對接試驗結果也為其提供了理論依據,因此在分子對接實驗基礎上研究了不同濃度的AX對α-淀粉酶的抑制作用。由圖2可知,在純化前和純化后,AX對α-淀粉酶的抑制率都隨著AX的濃度增加而增加,這說明AX對α-淀粉酶有一定的濃度依賴性,后期可以再詳細探討AX對α-淀粉酶的最佳抑制濃度。當AX的質量濃度達到5 mg/mL時,純化前和純化后的AX對α-淀粉酶的抑制率分別為53.81%和50.83%,表明純化過程并沒有顯著改變AX對α-淀粉酶的抑制效果。然而,無論是純化前還是純化后,AX對α-淀粉酶的抑制率都低于0.2 mg/mL的陽性對照藥物阿卡波糖的抑制率,這說明AX對α-淀粉酶的抑制能力相較于陽性對照有限。此外,純化后的AX對α-淀粉酶的制率略低于純化前的AX,這可能是因為在純化過程中除去了一些對降糖活性有協同作用的物質,導致純化后的AX降糖活性稍有降低。

圖2 不同質量濃度的AX對α-淀粉酶的抑制情況Fig.2 Inhibition of α-amylase by different concentrations of AX

2.3 酶促反應動力學分析

抑制作用的雙倒數圖是一種分析酶的抑制劑類型和解離常數的方法。不同類型的抑制劑會導致雙倒數圖上直線的斜率、截距和交點發生變化。實驗對AX純化物進行了酶促反應動力學分析,Lineweaver Burk曲線圖中,因Km和Vmax的比值為斜率,1/Vmax值為y軸截距。由圖3抑制作用雙倒數圖可知,斜率隨樣品濃度增加逐漸增大,1/[S]與1/V存在良好的線性關系,1/V隨著1/[S]逐漸增大,并且兩者的線性回歸方程延長線交于第三象限,x軸截距都隨濃度增加而減小,y軸截距都隨濃度增加而增大。因此根據酶抑制類型的判斷原理,表明AX對α-淀粉酶為競爭非競爭混合型抑制。

圖3 抑制作用的雙倒數圖Fig.3 Double reciprocal diagram of inhibition

2.4 熒光光譜分析

酶抑制作用的熒光光譜分析是一種利用熒光標記的檢測技術,可以研究酶與抑制劑之間的結合情況和動力學參數[22]。熒光光譜法分動態猝滅和靜態猝滅兩種,前者是熒光物質與猝滅劑激發態碰撞降低熒光強度,后者是熒光物質與猝滅劑基態配合降低熒光強度和吸收光譜。比較吸收光譜和發射光譜可判斷酶抑制作用的猝滅類型[23]。由圖4可知,在波長300～400 nm,熒光強度均隨AX濃度的增加而減小,且經公式(4)計算,AX與α-淀粉酶在18 ℃和37 ℃的猝滅速率常數Kq分別為1.02×1011和1.28×1011,隨溫度增加而減小,且大于最大散射碰撞淬滅常數2×1010L/(mol·s)。因此AX與α-淀粉酶發生了靜態猝滅[24]。并且,隨著AX濃度的變化,熒光猝滅效果更加明顯,AX濃度的增加,可能會促進更多蛋白酶殘基參與AX的結構嵌合,使復合物結合更牢固。

a-18 ℃;b-37 ℃

2.5 酵解過程中pH的變化分析

實驗研究了AX純化物的酵解特征,其中pH的變化是模擬人糞便發酵模型的關鍵指標之一,可以反映AX的發酵過程和程度,并評價AX的性能[25]。圖5為不同時間點的pH變化情況,可以觀察到在結腸發酵的過程中,2組樣品的pH值都有明顯的下降趨勢。與空白對照相比,樣品組從初始的8.8降到24 h時的5.1左右。而且在相同的發酵時間條件下,AX組的pH值普遍低于對照組的pH值,其實驗結果與KAUR等[26]實驗結果一致,這可能是由于AX組在發酵過程中產生了更多的SCFAs,從而降低了培養液的pH值。這一結果說明,AX具有調節結腸發酵環境的pH值的作用。

圖5 不同時間內pH變化情況Fig.5 pH change in different time

2.6 酵解過程中SCFAs的變化分析

SCFAs作為發酵的主要代謝產物,在腸道屏障功能中發揮重要作用,它通過調節腔內pH值、黏液產生,為上皮細胞提供燃料和影響黏膜免疫功能來實現[27]。因為SCFAs是腸道內穩態的一個重要指標,與人類健康之間有很強的聯系。近年來,SCFAs是代謝靶點的觀點被廣泛接受。因此,實驗采用氣相色譜法測定發酵過程中(0、3、6、12、18、24 h)中SCFAs的產生,以評估AX對腸道微環境的潛在影響(圖6)。

a-混標液;b-樣品

由表3可知,在實驗期間,AX結腸發酵組的總SCFAs含量隨著發酵時間的延長而增加,在發酵24 h后,SCFAs總含量達到最高值,為1 705.74 μg/mL,是初始發酵組的3.5倍。而空白對照(未添加AX)在不同時間內SCFAs總含量與初始發酵組相比無明顯變化。結腸發酵組中含量最高、變化最大的是乙酸、丙酸、丁酸等,占SCFAs總含量的90%以上,而已酸無明顯變化。WONG等[28]研究表明,在結腸中,膳食纖維發酵成SCFAs(尤其是乙酸、丙酸和丁酸)能夠改善菌群組成并降低患結腸相關疾病以及某些代謝綜合征(如肥胖、糖尿病、慢性腎臟疾病和全身性炎癥)的風險。SCFAs中,特別是丙酸和丁酸,具有良好的生理活性。除了為結腸細胞提供能量外,還在信號傳遞中發揮重要作用。SCFAs可刺激腸道L細胞分泌飽腹感誘導激素肽酪氨酸酪氨酸、胰高血糖素樣肽-1,抑制炎癥反應。丙酸被門靜脈吸收后,在肝臟中抑制一個或多個代謝途徑,通過減少羥甲基戊二酰輔酶A還原酶活性和抑制乙酰輔酶A還原酶催化乙酸變成乙酰輔酶A的過程,從而降低血漿膽固醇含量、降低患心血管疾病的風險。丁酸可以抑制癌細胞的增殖和加快凋亡,而不影響正常上皮細胞的增殖和分化。丁酸的存在被認為對結腸癌患者有保護作用。因此,將適當的AX引入腸道,以確保腸道細菌產生更高的丁酸或丙酸是有益的。并且根據AX在不同發酵時間內SCFAs的變化情況表明,AX能夠顯著促進腸道微生物產生SCFAs,有利于維持腸道健康和代謝平衡。

表3 不同發酵時間內各發酵液中SCFAs含量 單位:μg/mL

3 結論

實驗研究了從刺梨果渣中提取的AX的降糖及酵解特征。在降糖活性研究中,采用了多種實驗方法,包括分子對接、酶抑制、酶動力學、熒光光譜,從不同角度評價AX對α-淀粉酶的抑制能力及作用原理。分子對接結果顯示小分子與α-淀粉酶之間通過氫鍵等作用結合而發揮抑制活性。體外酶抑制實驗表明,AX對α-淀粉酶具有一定的抑制作用,其抑制類型為混合型抑制,且AX與酶發生靜態猝滅。在結腸發酵的過程中,AX發酵前后pH值有明顯的下降趨勢。從初始的8.8降到24 h時的5.1左右。而且在相同的發酵時間條件下,AX組的pH值普遍低于對照組,SCFAs含量在發酵過程中顯著增加,24 h后達到1 705.74 μg/mL,是初始發酵組的3.5倍。其中含量最高、變化最大的是乙酸、丙酸、丁酸等,占SCFAs總含量的90%以上,而已酸無明顯變化。因AX對α-淀粉酶有較好的抑制能力,且SCFAs在維持宿主腸道穩態和健康狀態方面起著關鍵作用,以上表明AX有望成為一種具有降糖及促進腸道健康的功能性食品?？傊?研究結果揭示了AX的潛在健康益處,為進一步研究和開發提供參考,但刺梨果渣中富含多種功能活性成分,除了本文所研究的降糖、體外模擬酵解,還可以進行抑菌、抗腫瘤、降尿酸等研究,從而更好地開發利用刺梨果渣。