miR-155 靶向SMAD2 在小鼠狼瘡腎炎足細胞損傷和炎性反應中的影響

張 潔，徐璐瑤，吳昱升，王 蓉，楊嵐茵，藍夢麟，林雨倩，黃艷琴，林 栩

（1.右江民族醫學院附屬醫院腎內科，廣西 百色 533000；2.廣西免疫相關性疾病醫學科研基礎保障重點實驗室，廣西 百色533000）

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中較常見的并發癥之一，也是導致SLE 患者死亡率增加的主要危險因素[2]。LN 直接影響腎臟的功能，可能導致嚴重的腎損害和衰竭[3]，因此針對LN 展開相關研究至關重要。 MicroRNA-155 是微小RNA(miRNA)超家族的成員，在調節血細胞生成、炎癥和免疫應答中起重要作用[4]。miR-155 是LN 的重要危險因素[4,5]，有研究表明，miR-155 對足細胞損傷有影響[6,7]。SMAD 家族成員2（SMAD2）作為TGF-β 的下游分子，在將TGF-β 超家族配體的細胞外信號轉運到細胞核過程中起重要作用[11,12]，而且研究發現SMAD2 參與腎纖維化進程[13]。生物信息學分析及文獻報道表明,miR-155 與SMAD2 具有靶向調控關系[11,14]，但其在LN 中的作用機制尚不明確。本研究旨在探索miR-155 調控SMAD2 表達在LN 中發揮的作用，為進一步理解LN 的發病機制，以及探索新的治療策略和靶向治療提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

1.1.1 實驗動物 6 周齡MRL/lpr 雌性小鼠40 只及C57BL /6 雌性小鼠8 只，江蘇華創信諾公司,許可證編號：SCXK(蘇)2020-0009。喂養、取材以及實驗等操作均于廣西百色市右江民族醫學院動物實驗中心（SPF 級）進行,適應環境一周后用于實驗。本實驗由廣西百色市右江民族醫學院倫理委員會審批通過后開展相關性實驗，審批號：20200630001，整個實驗過程全部嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》規范要求進行。

1.1.2 實驗試劑 蘇木素（Sigma）、伊紅、二甲苯（國藥集團）、AAV9 腺相關病毒（漢恒生物）、尿蛋白試劑盒 (南京建成) 、TRIzol Reagent( invitrogen) 、miRNA 逆轉錄試劑盒、SYBR Master Mix（翌圣生物）、內參U6、引物(上海生工) 。RIPA 裂解液(英文特生物) 、PMSF、20X TBST、牛血清白蛋白、4%多聚甲醛（北京索萊寶）、PAGE 凝膠快速制備試劑盒、BCA 試劑盒 (上海雅酶生物) 、PVDF 膜（美國Millpore）。 P-cadherin 、nephrin 和SMAD2 抗 體(Abcam) 、ECL 發光劑、GAPDH 、山羊抗兔免疫球蛋白(H+L)HRP (江蘇親科生物) 。濃縮型正常山羊血清、光（CY3）標記羊抗兔IgG（武漢博士德生物）、 IL-6 和TNF-α、DAPI（碧云天）、抗熒光淬滅劑（southernbiotech）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 (1) 空白組:C57BL/6 雌性小鼠尾靜脈注射生理鹽水（0.2 mL/只）；(2)模型組：MRL/lpr 雌性小鼠尾靜脈注射生理鹽水（0.2 mL/只）；(3) AAV9-miR-NC 組：MRL/lpr 雌性小鼠尾靜脈注射miR-155 上調陰性對照AAV（0.2 mL/只）；(4) AAV9-miR-155組：MRL/lpr雌性小鼠尾靜脈注射miR-155 上調AAV（0.2 mL/只）；(5) AAV9-miR-anti組：MRL/lpr雌性小鼠尾靜脈注射miR-155抑制AAV（0.2 mL/只）；(6)AAV9 -miR-anti-NC 組：MRL/lpr雌性小鼠尾靜脈注射miR-155 抑制陰性對照AAV（0.2 mL/只）。

1.2.2 miR-155-5p 靶基因預測 通過在線靶基因預測網站Target genes(http://www.targetscan.org/vert_71/)預測miR-155-5p 與SMAD2 的結合位點。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測實驗 構建LT-m-smad2-3UTR-wt、LT-m-smad2-3UTR-mut質粒（漢恒上海），通過Lipofectamine3000 轉染試劑分別 將 LT-m-smad2-3UTR-wt 和 LT-m-smad2-3UTR-mut 分 別 與 miR-155-5pmimics 和miR-155-5p-NC 共轉染至293T 細胞，轉染48 h 后檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.2.4 HE 染色 取腎臟組織經4%多聚甲醛固定組織樣本，固定時間為24 h，使用常規梯度乙醇進行脫水處理，然后用二甲苯進行透明化處理，接著進行石蠟包埋。隨后進行超薄切片處理，常規脫蠟，蘇木素染色，使用鹽酸乙醇進行分化處理，接著進行伊紅復染。最后使用梯度乙醇進行脫水處理，并使用中性樹脂進行封片。最終在光鏡下觀察組織的病理變化，并拍攝照片以進行進一步的分析。

1.2.5 尿蛋白水平 給予處理最后1 周收集小鼠尿液樣本，并使用考馬斯亮藍（CBB 法）來檢測尿液中的蛋白質含量。根據試劑盒的說明書進行操作，使用酶標儀在光波長為595 nm 測定光密度（OD）值。然后，根據以下計算公式計算尿液中蛋白質的濃度：尿蛋白濃度（mg/L）= 標準品濃度（524 mg/L）×（測定OD 值-空白OD 值） /（標準OD 值-空白OD 值）。

1.2.6 實時定量 PCR 法檢測 用 Trizol 提取各組細胞總RNA，測定RNA 濃度，然后將RNA 反轉錄合成 cDNA,具體操作按照逆轉錄試劑盒說明書進行，其以內參為U6，LightCycler96 實時熒光定量PCR 儀 進 行 擴 增。結 果 以 2-△△CT法 計 算 分 析miR-155 的相對表達量。引物見表1。

表1 qRT-qPCR 引物序列Tab 1 RT-qPCR primer sequences

1.2.7 Western blot 實驗 取凍存的腎臟組織制成勻漿，加入適量預冷 RIPA 緩沖液，充分混勻后在冰上裂解30 min。隨后離心提取總蛋白，并使用二巰基甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。取等質量的蛋白進行上樣，經凝膠電泳分離樣品蛋白，然后進行蛋白轉膜。取目的條帶后使用牛血清白蛋白制成的封閉液，在4 ℃下封閉3 h。封閉液稀釋一抗（nephrin、P-cadherin 和SMAD2）制成孵育液，稀釋比例為1∶1 000，在4 ℃過夜孵育。之后使用TBST 漂洗樣品3 次，加入稀釋比例為1∶6 000 的對應二抗孵育液，在室溫孵育2 h。再次用TBST 漂洗樣品3 次，最后使用ECL 發光劑進行顯影。分析使用Image J軟件對各組蛋白的灰度進行分析，以GAPDH 作為內參。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。

1.2.8 免疫熒光染色 取腎臟組織經4%多聚甲醛固定后，使用梯度酒精進行組織脫水、透明化、浸蠟和包埋切片。然后，使用二甲苯和酒精分別進行脫蠟處理。接下來進行抗原修復，將組織切片放入山羊血清中進行室溫封閉，封閉時間為30 min。之后，加入IL-6、TNF-α 的目標抗體進行孵育，將孵育過的切片放入4 ℃的濕盒中避光孵育過夜。隨后，分別滴加熒光標記物，將切片放入濕盒中，在37 ℃孵育1 h，然后滴加DAPI 進行染核。最后，使用含有抗熒光淬滅劑的封片液進行封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.9 統計學方法 采用 SPSS23.0 統計軟件，計量數據用以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-155 與SMAD2 存在靶向互作的關系

靶基因預測網站Target genes 結果顯示，miR-155-5p 與SMAD2 的3’-UTR 結構域有結合區域，見圖1。

圖1 miR-155-5p 與SMAD2-3' UTR 靶位點結合示意圖Fig 1 The binding diagram of miR-155-5p and SMAD2-3'UTR target site

2.2 雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-155與SMAD2 的靶向關系

轉染野生型SMAD2 基因表達載體WTSMAD2 后，與NC mimics 對 照 組 相 比，miR-155-5p-3' UTR-WT 的luciferase 的表達顯著下調（t=23.93，P＜0.001），而轉染突變型SMAD2 基因表達載體MUT- SMAD2 后，與NC mimics 對照組相比，miR-155-5p-3' UTR-MUT 的luciferase 的表達差異不 顯 著（t=0.126 9，P=0.905 1＞0.05）可 見，miR-155-5p 可以靶向調控SMAD2 的表達，見圖2。

圖2 雙熒光素酶實驗驗證miR-155-5p 靶向結合SMAD2Fig 2 Double-luciferase experiment to verify the targeted binding of miR-155-5p to SMAD2

2.3 尿蛋白水平

CBB 法檢測各組24 h 尿蛋白含量顯示，各組與空白組相比 ，尿蛋白呈現升高的趨勢（P＜0.05）。和模型組、AAV9-mir-NC 組相比， AAV9-miR-155組 尿 蛋 白 升 高（P＜0.001）；和 模 型 組 、AAV9-miR-anti-NC 組相比，AAV9-miR-anti 組尿蛋白呈降低趨勢（P＜0.001）；模型組、AAV9-miR-NC組和AAV9-miR-anti-NC 組的尿蛋白含量則差異不明顯（P＞0.05）。見圖3。

圖3 小鼠尿蛋白含量Fig 3 The levels of urinary proteins in mice

2.4 HE 染色

空白組：腎臟結構清晰，未見明顯增生變性。模型組鏡下出現腎小球系膜細胞增生 ， 伴有炎性細胞浸潤。AAV9-miR-155 組有腎小球細胞較明顯增生， 且有較多炎性細胞浸潤 。AAV9-miR-anti 組則腎組織結構輕度異常，腎實質可見少量炎癥細胞浸潤，個別腎小球基底膜增厚。AAV9-miR-NC組、 AAV9-miR-anti-NC 組則鏡下亦可見腎組織結構異常、腎小球系膜細胞增生和炎性細胞浸潤，病理改變嚴重程度與模型組相似。見圖4。

圖4 小鼠腎組織HE 染色（200×）Fig 4 The HE staining of renal tissue from mice（200×）

2.5 各組小鼠中miR-155 RNA 的表達水平

結果顯示，與空白組相比，模型組、AAV9-miR-155 組 和AAV9-miR -NC 組miR-155-5p 的 表 達 水 平 均 上 調（P＜0.05），和 模 型 組、AAV9-miR-NC 組 相 比，AAV9-miR-155 組miR-155-5p RNA 表達水平增加較顯著（P＜0.001），而AAV9-miR-NC 組和模型組相比差異不明顯（P＞0.05）；與空白組相比，模型組、AAV9-miR-anti 組和AAV9-miR-anti-NC 組miR-155-5p 表達水平均有上調（P＜0.05），和模型組、AAV9-miR-anti-NC 組相比，AAV9-miR-anti 組miR-155-5p RNA 有 降 低 趨勢（P＜0.001），而AAV9-miR-anti-NC 組和模型組相比差異不明顯（P＞0.05）。見圖5。

圖5 小鼠miR-155 RNA 的表達情況Fig 5 The expression of miR-155 RNA in mice

2.6 過表達及抑制miR-155 對nephrin、P-cadherin和SMAD2 蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組 P-cadherin（P＜0.01）、nephrin （P＜0.05）和SMAD2 （P＜0.001）蛋白表達均降低。 與模型組、AAV9-miR-NC 組相比，AAV9-miR-155 組nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表達量顯著降低（均P＜0.05）；而與模型組、AAV9-miR-anti-NC 組 相 比， AAV9-miR-anti 組nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表達增加（均P＜0.05）；另 外，模 型 組、AAV9-miR-NC 組、AAV9-miR-anti-NC組nephrin、P-cadherin和SMAD2蛋白差異不明顯（P＞0.05）。結果提示：模型組相對空白組SMAD2 蛋白表達降低，并且小鼠足細胞有所損傷；過表達miR-155-5p 抑制SMAD2 蛋白表達，并促進小鼠足細胞損傷，抑制miR-155-5p 可使SMAD2 蛋白表達增加，而小鼠足細胞損傷則有所改善。見圖6、7。

圖6 小空白組和對照組nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表達情況Fig 6 The protein expression of nephrin， P-cadherin and SMAD2 in blank and control groups

圖7 過表達和抑制miR-155 對nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表達影響Fig 7 Effects of overexpression and inhibition of miR-155 on nephrin， P-cadherin and SMAD2 protein expression

2.7 過表達及抑制miR-155 表達對IL-6、TNF-α 表達的影響

與空白組比較，其余各組 IL-6、TNF-α 蛋白熒光強度均表現為增加趨勢。 與模型組、AAV9-miR-NC 組 相 比， AAV9-miR-155 組IL-6、TNF-α 熒光強度均增加較顯著；與模型組、AAV9-miR-anti-NC組相比，AAV9-miR-anti組IL-6、TNF-α 則降低較顯著，模型組、AAV9 -miR-NC 組、AAV9-miR-anti-NC 組熒光強度未見明顯差異。見圖8、9。

圖8 各組腎組織 TNF-α 免疫熒光（400×）Fig 8 The kidney tissue TNF-α immunofluorescence for each group （400×）

圖9 各組腎組織 IL-6 免疫熒光（400×）Fig 9 The kidney tissue IL-6 immunofluorescencefor each group （400×）

3 討論

SLE 是一種慢性全身性自身免疫性疾病，其特征是異質性表現和多種自身抗體的產生［1，15，16］。目前，SLE 的發病機制尚不清楚，陽光照射或病毒感染可在具有遺傳易感性的個體中誘發疾病，其中女性是其中最脆弱的群體［1］。誘因激活先天免疫和適應性免疫，從而導致T 細胞激活自身反應性B 細胞，并導致免疫復合物沉積在組織中，引起自身免疫級聯反應，反應可能僅限于單個器官也可能涉及全身［17］。LN 是SLE 最常見和最嚴 重的并發癥之一，大約25%～50%的SLE 患者合并有LN，LN 顯示炎癥細胞因子高表達、腎小球腎炎和腎功能受損［15，16］，并且在 10%～20% 的患者中作為疾病的初始表現進展為終末期腎?。?8］。目前LN 療法在誘導緩解或預防新發作方面不夠有效，并非所有患者都表現出足夠的治療反應［19］。所以，對LN 發病機制進行研究，有助于探究疾病的治療策略，降低疾病的發生率。miRNA 在SLE 以及LN 中的腎臟發育和免疫病理、生理過程中起著關鍵作用，miRNA 失調可能導致腎臟細胞增殖異常、炎癥和腎臟纖維化［9，20，21］。

miRNA 是一種非編碼RNA 分子，由18～25 個核苷酸組成，可通過與mRNA 的3′非翻譯區（3′UTR）結合來調控目標基因的表達［4，9］。miRNA通過調控靶基因的表達，在細胞增殖、分化和凋亡等各種生理和病理過程中發揮重要作用［4］。miRNA 的異常表達會導致免疫性疾病，如自身免疫性疾 病 和 自 身 炎 癥 性 疾 ?。?2，23］。miR-155 是miRNA超家族的成員，介導先天性和適應性免疫應答，調節血細胞生成、炎癥和免疫應答［4］，參與SLE 進展和器官損傷［9］以及LN 的炎癥過程［4］。研究表明，外泌體miR-155 在SLE 患者中上調，外泌體miR-155 表達水平可作為診斷SLE 和LN 的潛在生物標志物［9］。此外，在狼瘡患者中的血液、尿液、外周血單核細胞、血漿中也發現了顯著上調的miR-155［5，8，10］。這些研究表明，miR-155 參與LN 炎癥進程，并呈高表達。在本研究中，與空白組相比，模型組的miR-155 表達量增加，這與前人研究結果一致。

有研究發現，miR-155 的過表達可以促進足細胞中炎癥分子的產生，從而加重足細胞損傷［7］。足細胞在腎小球濾過和腎功能的維持中起著關鍵作用，而LN 蛋白尿的主要原因是足細胞損傷，其中細胞死亡或脫離導致足細胞丟失是腎小球疾病進展的關鍵，預防足細胞損傷在LN 治療中至關重要［15，16，24］。此外，足細胞在LN 中可能通過充當抗原呈遞細胞或通過分泌促炎細胞因子促進炎癥反應［25］。課題組前期研究發現，在 TGF-β1 干預的足細胞損傷模型中，CD2AP 與 podocin、synaptopodin表達均降低而miR-155 升高，還發現過表達miR-155 可 負 調 節 podocin、synaptopodin、CD2AP的表達，而低表達miR-155 可使 podocin、synaptopodin、CD2AP 表 達 上 調［6，10］?？?見，過 表 達miR-155可促進足細胞損傷，抑制miR-155 表達可改善足細胞的損傷，這與前人的研究結果一致，因此推測miR-155 可通過促進足細胞損傷參與LN 炎癥進程。然而，目前miR-155 在LN 的調控機制并未完全清楚。

Smad 蛋白家族是近年來通過遺傳篩選方法在無脊椎動物中鑒定出的一種細胞內信號蛋白［26，27］。已經表明，Smad 蛋白是TGF-β 信號通路的關鍵中間體。Smad 蛋白家族是將TGF-β 與其受體結合產生的信號從細胞質傳遞到細胞核的中間分子，在信號傳遞和調節下游靶基因的轉錄中發揮重要作用［26］。SMAD2 是SMAD 蛋白家族其中一員，為受體調節型 SMAD（R-SMAD），作為轉錄因子發揮功能［28］。TGF-β/Smad 信號通路介導了炎癥和腎纖維化，其中TGF-β1 的介導因子包括Smad2 和Smad3，研究發現敲除Smad2 可顯著減輕腎纖維化［13］。有研究報道，miR-155 可以和SMAD2 靶向結合［11，14］。本研究通過生物信息學分析發現miR-155-5p 與Smad2 的3′ UTR 存在相互補的結合位點，兩者間可能存在較為可靠的靶向關系。進一步通過雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示， miR-155-5p 能夠靶向調控SMAD2 的表達。

為了明確miR-155-5p 是否通過SMAD2 對LN起調控作用，本研究對小鼠進行腺相關病毒AAV9轉染干預，分別上調和下調miR-155-5p 的表達，結果表明miR-155-5p 不僅可與 SMAD2 靶向結合，還負向調控 SMAD2 的表達。 此外，過表達miR-155-5p 可加重小鼠足細胞損傷和狼瘡腎炎的炎性反應，而下調miR-155-5p 表達可改善小鼠足細胞損傷和炎性反應。綜上，下調miR-155 可通過促進SMAD2 來改善小鼠足細胞損傷和腎臟的炎性反應，本研究為探索miR-155 在狼瘡腎炎的作用提供了新思路。

作者貢獻度說明：

張潔：實驗設計與操作，論文撰寫；徐璐瑤：數據整理與統計分析；吳昱升、王蓉、楊嵐茵、藍夢麟、林雨倩、黃艷琴：實驗操作助手；林栩：研究指導，論文修改，經費支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。