北豆根配方顆粒質量評價

曹桂云，莊雪松，寧 波，林永強，王岱杰，崔偉亮，劉洪超，董曉弟，黃蒙蒙，孟兆青*

［1.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東省中醫藥治療呼吸系統疾病技術創新中心，山東 濟南 250103； 2.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101； 3.齊魯工業大學（山東省科學院），山東省分析測試中心，山東 濟南 250014］

北豆根為防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricumDC.的干燥根莖，功效清熱解毒、祛風止痛，用于治療咽喉腫痛、熱毒瀉痢、風濕痹痛［1］，主要活性物質為木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿等生物堿類成分［2］，具有良好的抗炎、抗氧化、鎮痛、心血管保護活性［2-6］，其提取物已被開發成多種制劑，如北豆根片、北豆根膠囊等，并收載于2020 年版《中國藥典》。

中藥配方顆?？芍苯記_服使用，符合現代人需求，已成為臨床用藥的重要形式。2021 年國家藥品監督管理局頒布《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》［7］以規范配方顆粒標準制定工作，保障其用藥質量與安全。雖然北豆根配方顆粒在臨床上已得到廣泛應用，但尚無按照上述要求進行質量標準研究的報道，不利于其質量評價。因此，本實驗基于標準湯劑建立北豆根配方顆粒特征圖譜及多成分含量測定方法，同時對兩者化學成分進行一致性對比，以期為該制劑臨床應用提供參考。

1 材料

安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； XS105 型電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）； BSA224S-CW 型電子天平［萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］；TS8606 型凍干機（德國菲維科公司）； KDM 型可調控溫電熱套 （山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）。木蘭花堿對照品（上海鴻永生物科技有限公司，批號130015-202105，純度≥98.0%）； 蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿對照品（江蘇永健醫藥科技有限公司，批號200056-190103、200470-210103，純度95.3%、94.4%）。北豆根共15 批，具體見表1，經山東省食品藥品檢驗研究院林永強主任藥師鑒定為正品，根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》 制備標準湯劑，除去雜質，洗凈，潤透，切厚片，干燥，得到對應批次飲片（批號與藥材相同），分別取至少100 g，浸泡30 min 后煎煮2 次，武火煮沸，文火煎煮時間分別為20、15 min，加水量分別為9、7 倍，煎煮液趁熱用200目篩過濾，60 ℃減壓濃縮，冷凍干燥72 h，得到凍干粉（編號S1 ～S15）。北豆根配方顆粒（山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，每1 g 相當于飲片5.0 g，批號 2010001、2010002、2010003，由20090011 批號飲片制備）。乙腈為色譜純（美國Fisher Scientific 公司）； 三乙胺為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）； 其他試劑均為分析純； 水為蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

2 方法與結果

2.1 HPLC 特征圖譜建立

2.1.1 色譜條件與系統適用性考察 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.05% 三乙胺 （B），梯度洗脫（0～5 min，5%A； 5～15 min，5% ～15%A； 15 ～25 min，15% ～20% A； 25 ～45 min，20% ～60% A；45～50 min，60% A）； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長290 nm； 進樣量10 μL。理論塔板數按蝙蝠葛堿計，應不低于5 000。

2.1.2 供試品溶液制備 取配方顆?；驑藴蕼珓﹥龈煞圻m量，研細（過5 號篩），取約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50% 甲醇25 mL，稱定質量，回流提取30 min，放冷，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 對照藥材、對照品溶液制備 取北豆根對照藥材0.2 g，按“2.1.2” 項下方法制備對照藥材溶液。取蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿對照品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分別含兩者20、35 μg 的對照品溶液（現配現用，避光保存）。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 取糊精（配方顆粒所用輔料） 適量，按“2.1.2” 項下方法制備，即得。

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 專屬性試驗 取配方顆粒供試品、對照藥材、對照品、陰性樣品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 北豆根配方顆粒專屬性色譜圖Fig.1 Specific chromatogram of Beidougen Formula Granules

2.1.5.2 重復性試驗 取同一批樣品，按“2.1.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以第6 個峰為參照，測得各標識峰相對保留時間、相對峰面積RSD 分別在0～1.50%、1.35% ～4.23%范圍內，表明該方法重復性良好。

2.1.5.3 中間精密度試驗 由不同分析人員在不同日期對同一批樣品按“2.1.2” 項下方法制備6份供試品溶液，由2 臺儀器在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各標識峰相對保留時間、相對峰面積RSD 分別在0.05% ～1.64%、2.13% ～4.93%范圍內，表明該方法中間精密度良好。

2.1.5.4 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下各精密吸取10 μL 進樣測定，測得各標識峰相對保留時間、相對峰面積RSD 分別在0.05% ～2.12%、1.68% ～3.55%范圍內，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.5.5 耐用性試驗 在“2.1.1” 項色譜條件下分別采用3 根Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，序 列 號 02243106323647、02243106323664、02183031012465） 測定同一份供試品溶液，測得各標識峰相對保留時間RSD 均在1.23% ～2.48%范圍內，并且不同儀器上均在0 ～3.46%范圍內，不同體積流量下均在0 ～5.55% 范圍內，不同柱溫下均在0 ～2.17%范圍內，表明該方法耐用性良好。

2.1.6 圖譜生成 按“2.1.2” 項下方法制備標準湯劑、配方顆粒供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統” 進行分析，經多點校正和Mark 峰匹配后生成標準湯劑對照特征圖譜（圖2），共標定了7 個特征峰，與對照品比對后確定了峰1 （木蘭花堿）、峰6 （蝙蝠葛蘇林堿）、峰7 （蝙蝠葛堿），并以6 號峰為參照（S），計算其余特征峰相對保留時間和相對峰面積，結果見表2。

圖2 北豆根標準湯劑對照特征圖譜Fig.2 Reference specific chromatogram of Beidougen Standard Decoctions

表2 共有峰相對保留時間和相對峰面積Tab.2 Relative retention time and relative peak areas of common peaks

2.1.7 相似度分析 3 批配方顆粒與標準湯劑的相似度均大于0.9，與相應批次飲片標準湯劑凍干粉的相似度均大于0.95，表明兩者相似度較高；15 批標準湯劑與對照特征圖譜的相似度均大于0.86，表明其制備工藝較穩定。

2.1.8 聚類分析 以共有峰峰面積為變量，采用SPSS 20.0 軟件進行聚類分析，結果見圖3。由此可知，當刻度距離為15 時聚為2 類，S2、S3、S6、S9、S13、S14 為一類，其余批次為一類； 不同省份飲片所制備的標準湯劑無明顯區別，其中吉林、河北、山東產均可選用，但應制定內控標準。

圖3 15 批北豆根標準湯劑聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis dendrogram of fifteen batches of Beidougen Standard Decoctions

2.2 HPLC 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性考察 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.05% 三乙胺 （B），梯度洗脫（0～5 min，5%A； 5～15 min，5% ～12%A； 15 ～25 min，12% ～45%A； 25～40 min，45% ～60%A）； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長290 nm；進樣量10 μL。理論塔板數按蝙蝠葛堿計，應不低于5 000。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取木蘭花堿對照品10.71 mg，置于10 mL 量瓶中，30%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為1.049 6 mg/mL的貯備液。分別精密稱取經硅膠G 減壓干燥18 h 以上的蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿對照品10.83、11.13 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（兩者質量濃度分別為1.032 1、1.050 7 mg/mL）（現配現用，避光保存）。

2.2.3 供試品溶液制備 同“2.1.2” 項。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 專屬性試驗 取配方顆粒供試品、對照品、空白溶劑、陰性樣品溶液適量，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖4。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖4 各成分HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.4.2 線性關系考察 精密量取木蘭花堿貯備液適量，置于10 mL 量瓶中，30%甲醇定容并稀釋至25.28、50.57、101.14、252.84、505.68 μg/L；精密量取蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿貯備液適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容并稀釋，其中前者質量濃度分別為 25.81、51.61、103.21、206.42、412.84 μg/L，后者質量濃度分別為26.27、52.53、105.07、210.13、420.27 μg/L，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，平行2 次。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表3，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.4.3 重復性試驗 精密稱取同一批配方顆粒，共6 份，按“2.2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿含量RSD 分別為0.82%、1.41%、0.48%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.4 穩定性試驗 按“2.2.3” 項下方法制備供試品溶液，常溫下于0、4、8、12、24、48 h在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿含量RSD 分別為0.37%、0.35%、2.12%，表明溶液在48 h 內穩定性良好。

2.2.4.5 中間精密度試驗 由不同分析人員在不同日期分別按“2.2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，采用不同儀器在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿含量RSD 分別為1.43%、2.57%、1.16%，表明該方法中間精密度良好。

2.2.4.6 耐用性試驗 按“2.2.3” 項下方法制備供試品溶液，分別采用3 根Waters XBridge C18色譜柱 ［4.6 mm×250 mm，5 μm，序列號 （SN）02243106323647、02243106323664、02183031012465］，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿含量RSD 分別為2.81%、2.34%、2.73%，表明該方法耐用性良好。

2.2.4.7 加樣回收率試驗 取0.1 g 配方顆粒，分別加入木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿貯備液1.85、0.93、0.64 mL，按“2.2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿平均加樣回收率分別為101.05%、100.32%、99.78%，RSD 分 別 為0.81%、1.29%、1.74%。

2.2.5 出膏率、成分含量、轉移率測定 先計算出膏率。再取15 批標準湯劑、3 批配方顆粒，按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算成分含量。然后，取15 批北豆根飲片粉末（過3 號篩），每批約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入30% 甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流提取0.5 h，放冷，30%甲醇補足減失的質量，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算轉移率。結果見表4～5。

表4 北豆根標準湯劑出膏率、成分含量、轉移率測定結果Tab.4 Results for paste rate，constituent content and transfer rate determination of Beidougen Standard Decoctions

表5 北豆根配方顆粒出膏率、成分含量、轉移率測定結果Tab.5 Results for paste rate，constituent content and transfer rate determination of Beidougen Formula Granules

3 討論

3.1 標準湯劑制備 《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》 規定，配方顆粒研究需以標準湯劑為橋梁，后者為衡量中藥配方顆粒與其相應飲片臨床湯劑一致性的物質基準。本實驗在上述規定基礎上，收集15 批代表性北豆根藥材并炮制成飲片，以出膏率及木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿轉移率為指標對標準湯劑制備工藝進行優化，再進行質量檢驗，用于制定相關質量標準。

3.2 指標成分選擇 蝙蝠葛堿、蝙蝠葛蘇林堿、木蘭花堿是北豆根主要成分，具有抗炎、保護神經細胞、降壓、抗氧化等活性，與藥材功效相關［8-17］，并且蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿也是2020年版《中國藥典》 北豆根藥材及飲片的質量控制指標。因此，本實驗以上述3 個化合物為指標，保證了測定成分的代表性和測定方法的適用性。

3.3 指標成分含量范圍、轉移率范圍制定 文獻［8］ 報道，以指標成分含量平均值加減3 倍SD（或70% ～130% 平均值） 為含量、轉移率允許范圍。結果，北豆根標準湯劑中木蘭花堿含量平均值為31.48 mg/g，其加減3 倍SD、70% ～130%范圍分別為11.97 ～51.00、22.04 ～40.93 mg/g，但前者過寬，不利于產品質量控制，故后者較合理； 北豆根配方顆粒中木蘭花堿含量范圍取標準湯劑按制成量折算后70% ～130% 平均值，即16.64 ～30.90 mg/g。另外，木蘭花堿從飲片到標準湯劑的轉移率為45.42%，其平均值加減3 倍SD 范圍也過寬，故取70% ～130%。同法制定蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿含量、轉移率范圍。

4 結論

目前，配方顆粒與傳統湯劑的一致性問題受到了廣泛關注，但僅有少數品種進行了相關研究［18-19］，主要包括（1） 大多數研究開展時間較早，采用企業標準配方顆粒進行對比，所得結論無法為現行配方顆粒質量控制及臨床應用提供參考；（2） 部分實驗設計的科學性較差，導致結論可信度較低，故應針對配方顆粒湯劑和傳統湯劑等效問題進行深入考察。本實驗以北豆根配方顆粒為研究對象，從出膏率、指標成分含量和轉移率、特征圖譜一致性等方面出發，與相應標準湯劑所含成分進行比較，既可為該制劑臨床應用提供參考，也能為其他配方顆粒相關研究提供思路。