灰霉病致病機理及其防治措施研究進展

王方方，付清泉，史學偉，王 斌

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

灰霉病是由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的一種常見真菌病害，發生在植物的莖、葉、花、果實和種子等部位[1]，可以引起1 000 多種果蔬發病，受到侵染的果蔬表面會出現白色或灰色的霉斑，受感染的部位會出現軟腐爛和褐變，在全球范圍內造成巨大的經濟損失（超過100 億美元）[2]。B.cinerea 更容易侵染受損或衰老組織，導致植物損傷嚴重甚至死亡，并且具有傳播速度快、寄主范圍廣和病原菌遺傳變異性高等特點，被稱為世界第二嚴重植物病原體[3]。研究表明，B.cinerea 通過侵入寄主的表皮進行繁殖，產生一些細胞降解酶（CWDEs）[4]、毒素[5]、有機酸[6]等物質來調控灰霉病的發病，或者通過基因來調控灰霉病的發病[7]。針對B.cinerea 引發的果蔬腐敗有多種防治方法，包括化學防治[8]、農業防治[9]和生物防治[10]，這些方法均是通過降低菌體感染率來控制灰霉病的爆發。

本文總結了植物生長過程中不同部位（葉片、花序和果穗）感染灰霉病的主要癥狀，影響植物灰霉病發病的重要因素，B.cinerea 致植物灰霉病的分子機理，以及植物灰霉病防治技術，旨在為果蔬灰霉病防治相關研究提供理論參考。

1 灰霉病的癥狀及發病特征

1.1 癥狀

B.cinerea 對植物的危害分布在植物生長的整個時期，從葉片部位一直到花序、果穗都可能受到危害。首先會侵染葉片，主要表現為葉片多從葉尖或葉邊緣開始發病，葉片邊緣有棕色“U”或“V”形損傷，出現淡褐色且不規則病斑，發病嚴重時病斑呈現不規則輪紋，環境較潮濕時，病葉組織的下側可以觀察到大量的灰色孢子[11]。對花序、果穗的危害主要分為兩個時期：第一個時期是在開花前及幼果時期，花序被病菌感染初期呈淡褐色水漬狀，后期發病部位逐漸轉為暗褐色，病部組織軟腐，進一步發展至萎蔫甚至壞死[12]。第二個時期是在果實著色至成熟期階段，果穗上的果實呈火柴頭大小時就會染病，產生淡褐色、水浸狀病斑，后病斑變為褐色[13]。漿果在早期受到侵染時會出現圓形的凹陷病斑，雖然果實的硬度沒有受到影響，但果皮上出現的病斑顏色和正常組織的顏色相比較淺[14]。

1.2 發病特征

B.cinerea 是一種壞死性兼性腐生病菌，對外界環境的要求不高，其不僅會在田間發病，還會在貯藏、運輸過程中造成感染，進而引起果蔬腐爛，質量下降等不良效果[15]。B.cinerea 擁有廣泛的寄主范圍和多種攻擊模式[16]，并對多種水果、谷類、葉菜、豆類產生病害，尤其會影響葡萄、草莓、番茄等農作物產量，造成嚴重經濟損失[17]。B.cinerea 主要以菌絲體或菌核隨病殘體在土壤中越夏或越冬，病原菌萌發產生的分生孢子和菌絲，會伴隨空氣、雨水和人類的生產活動等方式進行傳播[18]。外界環境主要是冠層內的小氣候條件會影響灰霉病的發病，其中的溫度和濕度（相對濕度和自由濕度）更是B.cinerea 感染的關鍵因素[19]。當相對濕度低于81%時，分生孢子不能萌發，在90%～98%時開始大量萌發，分生孢子在0～30 ℃之間萌發，最適溫度為20～25 ℃[20]。B.cinerea 是一種適應偏低溫度和較高濕度的病原菌，當外界環境持續低溫、高濕或光照不足時，植物更容易受到感染，導致嚴重發病[21]。除了溫度和濕度影響灰霉病的發病外，各地區品種的不同[22]、大氣CO2濃度[23]、定植密度過大[24]、施肥不科學[25]、生長調節劑超量使用[26]等因素都對灰霉病的發病有誘導作用。

2 B.cinerea 的致病機理

B.cinerea 對宿主的致病過程包括侵入宿主表皮，殺死植物細胞和引起組織腐爛三個階段[27]。在致病過程由多種毒素、酶、代謝物、基因等因素共同調控[5]。

2.1 侵入表皮

分生孢子高度豐富且普遍存在，主要通過傷口或自然開口進入宿主細胞[28]。植物細胞壁是保護植物細胞應對外來風險的一道屏障，主要是由中膠層、初生壁以及次生壁構成，其成分主要是多糖和蛋白質，如果膠、纖維素和半纖維素等物質[29-30]。作為一種壞死性真菌，B.cinerea 附著胞體的強度不足以破壞植物細胞壁，且由B.cinerea 造成的植物表皮損傷以及機械損傷現象很少見，但B.cinerea 能分泌一系列細胞壁降解酶（CWDEs），降解宿主細胞壁，從而侵入宿主表皮[31]，例如分泌果膠酶和纖維素酶[29]、多酚氧化酶[32]、蛋白酶和磷酸酯酶[33]、木聚糖酶[34]、淀粉酶[35]等物質。其中果膠酶和纖維素酶是重要的兩個酶，果膠酶靶向作用于細胞壁中的大多數多糖，導致細胞壁裂解[29]。果膠酶和纖維素酶在協同作用下能促使細胞結構的破壞與解離，細胞壁被降解后會引起組織軟化，進而使得表皮的保護屏障受損，由此增加了擦傷的可能性，并為真菌提供了單糖作為碳源的途徑，有利于B.cinerea 的侵入、定殖和擴展[3]。此外，B.cinerea 還具有六種不同降解細胞壁的聚半乳糖醛酸酶（PGs）基因，它們是可以介導宿主相互作用和潛在宿主強化基因的強活性代謝物，其中多聚半乳糖醛酶是主要的降解酶，也是致病因子之一[36]。

2.2 殺死植物細胞

B.cinerea 裂解宿主細胞壁以達到破壞其表皮保護屏障的效果，在細胞壁裂解后會進一步侵入寄主細胞組織，破壞植物細胞，從而加速灰霉病的發生[37]。

2.2.1 毒素的致病作用

在B.cinerea 侵入植物表皮的過程中，會分泌一些植物毒性代謝物，主要為高倍半萜烯葡萄孢素（Sesquiterpen botrydial）和高取代內酯（Botcinolide）[31]。其中高倍半萜烯葡萄孢素是非特異性毒素且毒性最高，可以作用于多種農作物和基因，其侵染植物的能力很強，更容易引發感染[17]。除了這兩種毒素之外，草酸也是重要的植物毒性代謝物[29]?；移咸焰呙狗置诓菟峥梢越档椭参锛毎麅萷H 值并刺激果膠酶、蛋白酶等真菌酶的產生和活性。此外，草酸積累導致Ca2+螯合，進而削弱植物細胞壁的果膠結構[3]。這些毒素在B.cinerea 侵染中發揮著重要的作用，能夠破壞細胞膜的通透性，造成細胞的質壁分離和細胞器的損傷，加速B.cinerea 的侵染，同時也會使宿主產生褐色病斑、白化或者枯萎等癥狀，對宿主造成不同程度的危害[38]。

活性氧（ROS） 是公認植物免疫系統的重要組成部分，包括超氧陰離子（O2-·）、羥基自由基（-OH）和某些非自由基氧化劑如氫過氧化物（H2O2）和臭氧（O3），可以轉化為自由基[4]。在水果受到B.cinerea 侵染或生物、非生物因素脅迫時，植物與病原體相互作用會短時間產生大量的活性氧[39]。ROS 對入侵病原體具有直接的細胞毒性，可能通過促進角質層聚合物的氧化來滲透宿主細胞，ROS的過度產生會誘導植物的防御反應，由此造成大量H2O2的積累，最終可誘導超敏反應（HR） 的程序性死亡（PCD），宿主中高濃度的ROS 和隨后的細胞死亡阻礙了生物營養病原體的傳播[5]。

2.2.2 基因的調控

親環蛋白（Cyp）是與真菌形態發生和產生毒力相關的成分[36]。農桿菌轉化法（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，ATMT）已被證明是鑒定致病性相關基因的方法，通過ATMT 法表明了BcCYP2 是灰霉病菌產生毒力的相關基因，BcCYP2 的破壞不會損害病原體的菌絲生長、滲透、氧化和細胞壁的完整性，但會延遲分生孢子的萌發，改變分生孢子的形態，以及減少感染墊（IC）的形成，產生毒力降低的效果[40]。低聚半乳糖醛酸酶（Oligogalacturonase）被認為是植物防御反應的激發因子，它的分泌減少會降低植物的防御反應[41]。通過克隆編碼BcPg1 基因進行試驗，表明BcPg1 不會顯著影響初始感染的頻率，但可以觀察到參與試驗的果實和葉片的損傷生長速率有了顯著的降低，表明BcPg1 與灰霉病的毒力有關[42]。此外富含半胱氨酸的受體樣激酶（CRKs）也是普遍存在的植物受體樣激酶，它在植物抗病中起著重要作用，在灰霉病栽培品種中VaCRK2 接種和茉莉酮酸甲酯處理后，抗灰霉病的葡萄品種中VaCRK2 的表達明顯增強，引起致病機制相關基因（PR）的上調和活性氧（ROS）的積累，VaCRK2 能促使植物激活PR 基因的表達和氧化，從而對灰霉病病菌產生抗性[43]。除此之外還有BcVea[27]、Rho3[44]、Slt2-MAPK[45]、BOSI[46]等基因都是灰霉病病菌生長發育或致病的相關基因，都發揮著不同的作用。而且孢子的生長速率也和基因有著重要聯系，研究表明BcCYP2 介導B.cinerea 菌核的產生和形態發生，但對于孢子的萌發是必不可少的，bmp1 缺失突變體產生正常的分生孢子和菌絲體，但生長速度降低，說明孢子的生長速率和bmp1 有著不可分割的關系[47]。

3 防治措施

目前對灰霉病的防治策略為“預防為主，綜合防治”，主要通過化學防治、農業防治和生物防治技術對灰霉病進行防治。

3.1 化學防治

化學防治主要通過噴灑農藥進行，是目前國內使用最多的防治方法[9]。目前用于化學控制灰霉病的試劑主要包括苯并咪唑類、對二甲酯亞胺類、甲氧基丙烯酸酯類、環己酰胺、苯（芐）胺基嘧啶類、N-苯基氨基甲酸酯類等，具有高效、快捷、實用性強等優勢，其中最主要的殺菌劑為二甲酰亞胺類和苯胺基嘧啶類殺菌劑[48]。但是長期使用化學殺菌劑會引起植物的抗藥性，往往通過加大藥劑的使用量達到效果，而過度使用化學藥劑會造成藥劑的殘留，對人們健康存在潛在威脅，也會對環境、土壤造成污染，從而導致多方面的不利影響[49]。

通過對比不同殺菌劑對湖北省各地產區番茄和草莓采集的B.cinerea 的研究可知，腐霉利抗性菌株對二甲酰亞胺類殺菌劑存在正交互抗性，但對苯吡咯類殺菌劑沒有交互抗性[50]。而不同地區的草莓對于殺菌劑的抗藥性也不相同，通過對河北、北京、四川等6 個不同地區的草莓進行樣本采集，考察不同的殺菌劑對B.cinerea 的抗藥性頻率，研究表明在灰霉病菌樣本群體為251 時，乙霉威、腐霉利、多菌靈抗藥性頻率分別為67.33%、45.02%和64.94%，同時發現對以上殺菌劑都具有敏感性的菌株僅有3 株且頻率為1.2%，而且對3 種殺菌劑全部表現抗藥性的菌株為17.53%，以上研究表明樣本草莓B.cinerea出現了較為嚴重的多重抗藥性現象[51]。

為解決植物對化學殺菌劑產生抗性這一現象，主要措施是將幾種化學殺菌劑進行復合調配來延緩灰霉病的發病，但需要對殺菌劑的使用量進行進一步的調控，且針對不同產區的植物對不同化學殺菌劑的抗藥性問題需要分析考察當地地域特征，進一步確定合適的藥劑來對灰霉病進行有效的控制[52]。

3.2 農業防治

農業防治主要通過選育優良的抗病品種，在植物生長期階段清理病殘體[9]、控制溫度和濕度[3]、簇緊密度和稀疏、合理的人工輪作[53]、增加穿過和圍繞植物的光照和氣流[2]、衰老組織的物理去除等方式來降低灰霉病的感染率。

豇豆灰霉病主要通過農業防治來控制灰霉病的發病，將豇豆與蔥蒜、禾木類植物進行2～3 年的輪作或者將播種期提前因此來避開高溫和多雨時期，及時對種植地區的溫度、濕度、空氣等環境條件進行調控和處理，防止灰霉病發生或控制灰霉病的發病[54]。河南一地區通過農業防治、生態防治建立了綠色防控草莓示范基地，主要對草莓優質抗病的品種進行選育或對草莓進行脫毒種苗、合理進行肥料配比和施肥、及時摘除老葉和病葉，對有效抑制灰霉病的發病提供了一條綠色、高效、安全、環境友好的技術模式。在大棚草莓的灰霉病防治中僅僅只靠化學防治往往是不夠的，需要結合物理和生態的防治，特別是將已經發生病害的葉片或組織及時摘除，防止病原菌的進一步擴散造成更加嚴重的病害，再加上對大棚內濕度的控制、白天和晚上溫度的調整，實現了對大棚內草莓灰霉病的有效控制[55]。

雖然通過農業防治來控制灰霉病的發生能延緩灰霉病的發生，但農業預防局限性仍較大，尤其需要對外界溫度和濕度的要求十分嚴格，且需要及時地識別病害并且摘除病害，一旦控制不好會導致發病加劇[56]。

3.3 生物防治

生物防治對于灰霉病的控制具有較好的前景和潛力，因為微生物對環境的適應性較強，且菌種的來源廣泛、安全，表現出低污染、無毒殘留等優勢[57]。目前用于生物防治灰霉病的菌種主要為細菌和酵母菌等，通過不同的菌種來控制不同植物的灰霉病是有效的。拮抗生物的主要作用機制是通過寄生植物的寄生、營養的競爭、誘導系統獲得性抗性（SAR）、誘導系統性抗性（ISR）等多種防御機制的產生來防治灰霉病[58]。

用于生物防治的細菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等?？莶菅挎邨U菌NSW-3-1 是從黨參中篩選出來的一株具有較強抑制作用的細菌，當發酵液菌種濃度為1×108CFU/mL 時防治的效果最好，并且該菌株不僅有很好的抑制作用，而且可以促進黨參的生長，是一株良好的生物防治細菌[59]?？莶菅挎邨U菌L1-21 可以在植物內部組織定殖，具有良好的環境適應性，通過和B.cinerea 共同培養，枯草芽孢桿菌L1-21 表現出強烈的拮抗作用，且濃度越高疾病的發生率越低，從而達到了較好的控制效果[60]。從銀杏組織分離的內生細菌菌株中篩選出來了一株B.cinerea 抑菌活性較好的解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3的抑制作用最強，抑制率為79.06%，能夠顯著抑制病原菌的菌絲生長。此外木霉DQ-1、貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1、印楝內生放線菌R6 等植物中篩選出來的細菌都可以有效的控制灰霉病的發生且促進植物的生長，是優質的細菌生物防治菌[61]。

酵母作為采后灰霉病的生物防治菌株具有很好的抗菌效果。從水果中篩選出來了一株美極梅奇酵母（Metschnikowia zizyphicola）T-2，它可以通過產生揮發性有機物（VOCs）來減少藍莓在貯藏期引起的果實腐爛，通過對藍莓在儲藏期品質的感官指標、理化指標、風味指標等指標的測定發現美極梅奇酵母T-2 不會損害藍莓的品質，且該菌株會誘導藍莓體內的黃酮和酚類物質的積累來提高藍莓的抗性，通過將藍莓經過美極梅奇酵母T-2 的處理后平板培養發現其可直接抑制B.cinerea 的菌絲生長和孢子萌發[62]。白色念珠菌（Candida pseudolambica） 是一種常見于各種環境中的酵母，用從海洋中分離出來的一株白色念珠菌W-16 處理侵染B.cinerea 桃子的第3 天，發現灰霉病的發病率降低了41.2%，說明白色念珠菌W16 對桃子灰霉病的防治有較好的效果，且白色念珠菌W-16 產生的VOCs 抑制了B.cinerea 的菌絲生長和分生孢子的萌發，并引起了菌絲體形態和超微結構的異常，但其不會對桃子的品質產生影響[63]。美極梅奇酵母T-2、白色念珠菌W16 可以通過VOCs 與果實相互作用來提高其抗性和直接抑制B.cinerea 的生長，從兩個方面降低了宿主的發病率，除此之外還有解淀粉芽孢桿菌BP30、酵母菌KD-16J、間型假絲酵母C410 等多種酵母菌都可以較好的抑制灰霉病的發病[64]。

4 小結

灰霉病作為一種危害植物的真菌病害，嚴重時可以造成80%的減產，受到了人們廣泛的關注[65]?；颐共〉闹虏C制是多方面的，致病菌B.cinerea 通過侵入寄主表皮在植物組織中迅速生長，通過產生酶類、毒素、有機酸、基因等多方面影響植物生長。目前對灰霉病的控制主要通過化學、農業及生物防治方法，但化學試劑的過量使用會造成環境的污染和農藥殘留，嚴重危害了環境及人類健康，農業防治工程量較大且不易控制，相較而言生物防治的安全、無毒無害等優勢較明顯，應該積極發展生物方面對灰霉病的防治，加快環境友好型微生物菌劑的研制、升級和示范推廣?？傊每商娲呗詠砜刂撇『Φ陌l生已經成為了迫切的需求，安全、綠色、高效、可行的使用無公害綠色的防治手段日益受到了重視，成為今后科研的研究重點。