TRPM2離子通道在顳葉癲癇相關神經炎癥中的作用研究

王星辰?劉瑞寒?肖翔宇?夏敏?李秋波?孔慶霞

【摘要】目的 探討小膠質細胞及星形膠質細胞中的瞬時受體電位M2型（TRPM2）離子通道在顳葉癲癇（TLE）相關神經炎癥中的作用。方法 將大鼠隨機分為對照組和癲癇組，癲癇組采用氯化鋰-毛果蕓香堿（匹羅卡品）制作癲癇模型，對照組給予等劑量的生理鹽水代替，根據造模后觀察的時間將TLE大鼠隨機分為7個亞組（n = 5）：急性期（3 h組、6 h組、1 d組、2 d組）、潛伏期（14 d組）、慢性期（30 d組、90 d組）。檢測TRPM2在不同亞組TLE大鼠海馬中的表達及TRPM2在大鼠海馬中的細胞定位情況。采用過氧化氫（H2O2）誘導小膠質細胞BV2及星形膠質細胞C8細胞系，檢測細胞釋放IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，檢測H2O2誘導的BV2及C8細胞中TRPM2、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、磷酸化核因子κB p65蛋白（p-NF-κB p65）的表達變化，同時檢測H2O2誘導BV2細胞中鈣調神經磷酸酶（CaN）的活性變化。結果 急性期TLE大鼠海馬中的TRPM2表達升高（P < 0.05）。H2O2誘導的BV2及C8細胞中TRPM2的表達升高、炎癥因子釋放增加（P均< 0.05），H2O2可促進BV2細胞中PARP-1、p-NF-κB p65的表達并提高CaN、GSK-3β的活性（P均< 0.05）。結論 氧化應激可促進小膠質細胞及星形膠質細胞TRPM2及促炎細胞因子的表達，癲癇反復發作引起的氧化應激可能在小膠質細胞中通過TRPM2/CaN/ p-NF-κB p65通路介導TLE相關神經炎癥的發生。

【關鍵詞】TRPM2；顳葉癲癇；神經炎癥；小膠質細胞

Role of TRPM2 channel in temporal lobe epilepsy-associated neuroinflammation Wang Xingchen△， Liu Ruihan， Xiao Xiangyu， Xia Min， Li Qiubo，Kong Qingxia.△Cheeloo College of Medicine， Shandong University， Jinan 250012， China

Corresponding author，Kong Qingxia， E-mail： kxdqy8@sohu.com

【Abstract】Objective To investigate the role of transient receptor potential melatonin 2 （TRPM2） ion channels in microglia and astrocytes in temporal lobe epilepsy （TLE） -associated neuroinflammation. Methods Rats were randomly divided into the control group and epilepsy group. Seizure models were induced by lithium chloride-pilocarpine in the epilepsy group， and those in the control group were injected with the same dose of saline. The TLE rats were randomly divided into 7 subgroups according to the observation time after model establishment： acute phase （3 h group， 6 h group， 1 d group， 2 d group）， latent phase （14 d group） and chronic phase （30 d group， 90 d group） subgroups （n = 5）. The expression level of TRPM2 in the hippocampus of TLE rats at different stages were detected， and the cellular localization of TRPM2 in the brain of TLE rats was investigated. BV2 and C8 cell lines were induced by hydrogen peroxide （H2O2）. The levels of IL1-β， IL-6 and TNF-α released by BV2 and C8 cells were observed by ELISA. The levels of TRPM2， poly （ADP-ribose） polymerase 1 （PARP-1）， glycogen synthase kinase-3β （GSK-3β） and phosphorylated nuclear factor-κb p65 （p-NF-κb p65） were measured in H2O2-induced BV2 and C8 cells. Meantime， the activity of Calcineurin （CaN） in H2O2-induced BV2 was observed. Results The TRPM2 expression in 2d epileptic rat hippocampus was increased （P < 0.05）. The expression of TRPM2 and the release of inflammatory cytokines were increased in H2O2 induced-BV2 and C8 cells （both P < 0.05）. H2O2 could up-regulate the expression of PARP-1 and p-NF-κB p65 and enhance the activity of CaN in BV2 cells （all P < 0.05）. Conclusions Oxidative stress can up-regulate the expression levels of TRPM2 and pro-inflammatory cytokines in microglia and astrocytes. Oxidative stress caused by recurrent epilepsy may mediate the occurrence of TLE-associated neuroinflammation through the TRPM2/ CaN/p-NF-κB p65 pathway in microglia.

【Key words】TRPM2； Temporal lobe epilepsy； Neuroinflammation； Microglia

癲癇是一種嚴重的慢性神經系統疾病，全世界超過7 000萬人受其影響［1］。目前約30%的癲癇患者藥物治療效果不佳，進展為耐藥性癲癇，其中顳葉癲癇（TLE）是最常見的耐藥性癲癇類型［2-3］。

有證據表明，神經元興奮性增加伴隨著神經炎癥和活性氧的過度產生，且神經炎癥在癲癇的病理生理中起著重要作用，是耐藥性癲癇的共同病理特征［4-6］。因此，進一步了解神經炎癥在癲癇中的作用，為患者提供更多的治療方法十分必要。

瞬時受體電位M2型（TRPM2）離子通道是瞬時受體電位通道超家族中TRPM亞家族的第二個成員，被認為是一種氧化應激敏感的鈣離子（Ca2+）通透性通道，對過氧化氫（H2O2）等氧化應激產物的刺激高度敏感［7-8］。細胞內升高的Ca2+和ADP核糖（ADPR）可調節TRPM2離子通道的開放，此外，TRPM2也可被不同的應激因素調節，如酸性pH值、谷胱甘肽和高溫［9-11］。TRPM2廣泛分布于中樞神經系統，在神經元、星形膠質細胞及小膠質細胞中高表達，并參與氧化應激引起的神經元死亡［7］。Hu等［12］發現敲除TRPM2可抑制癲癇小鼠海馬中小膠質細胞和星形膠質細胞的激活，并可降低癲癇小鼠海馬中的神經炎癥反應，提示TRPM2在癲癇相關神經炎癥中發揮重要作用， 但相關的報道很少，潛在細胞和分子機制仍有待深入研究。

氧化應激下的TRPM2信號傳導主要圍繞聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP），尤其是PARP-1［13］?，F已證明H2O2等過氧化物可激活PARP-1，從而激活TRPM2離子通道，導致Ca2+內流，細胞內Ca2+穩態發生變化［14］。鈣調神經磷酸酶（CaN）在大腦中高表達，是已知的唯一對Ca2+信號高度敏感的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在調節神經免疫功能和神經炎癥過程中發揮著不可或缺的作用［15］。據報道，在神經源性細胞中，CaN可調節糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）絲氨酸-9的去磷酸化，導致GSK-3β的激活 ［16］。Jiang等［16］在研究雙相情感障礙時發現，TRPM2離子通道可通過激活CaN來調節GSK-3β的活性，而GSK-3β的激活可導致核轉錄因子-κB p65蛋白（NF-κB p65）的磷酸化和易位，加重炎癥反應［17］。由此推測，癲癇反復發作引起的氧化應激反應可通過促進PARP-1的產生激活TRPM2離子通道，介導Ca2+內流，并通過CaN/GSK-3β/ NF-κB p65通路介導神經炎癥的產生。本研究首次對TRPM2介導癲癇相關神經炎癥的主要作用細胞PARP-1/TRPM2/CaN/GSK-3β/ NF-κB p65通路在癲癇相關神經炎癥中的作用進行了探索，分析TRPM2在癲癇發生發展中的作用，為TLE的治療提供新的思路。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物

90只7～8周齡、體質量270～300 g的 SPF級雄性SD大鼠購自濟南鵬悅有限公司。

2.主要試劑與儀器

氯化鋰、阿托品、毛果蕓香堿（匹羅卡品）購自中國Macklin公司，TRPM2抗體、PARP-1抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗、離子鈣結合銜接分子 1（Iba-1）抗體、山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor R 647以及山羊抗小鼠IgG H&L Alexa Fluor R 555購自美國Abcam公司，TRPM2抗體（用于免疫熒光染色）購自中國ABclonal公司，p-NF-κB p65抗體購自美國Affinity公司，GAPDH抗體、超敏ECL蛋白印跡檢測試劑購自美國 Proteintech 公司，膠質纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）抗體購自中國BOSTER公司，過氧化氫（H2O2）購自美國Sigma-Aldrich公司，全細胞裂解試劑盒購自中國凱基生物公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，GENMED細胞CaN活性比色法定量檢測試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技生物有限公司。使用美國Bethesda的ImageJ軟件，美國GE公司的Image Quant LAS 500 生物分子成像儀，德國ZEISS公司的LSM800共聚焦顯微鏡。

二、實驗方法

1.分組與模型建立

采用隨機數表法將大鼠分為對照組和癲癇組，于癲癇組大鼠腹腔注射氯化鋰，18～20 h后腹腔注射阿托品，注射阿托品30 min后腹腔注射鹽酸匹羅卡品并進行行為學觀察，根據Racine評分進行分級，達到Ⅳ～Ⅴ級癲癇發作的大鼠為TLE造模成功大鼠［18］。對注射匹羅卡品30 min后未達到Ⅳ～Ⅴ級癲癇發作的大鼠，繼續每10 min注射10 mg/kg匹羅卡品，直至達到Ⅳ～Ⅴ級癲癇發作（最多追加5次）。對驚厥持續1 h的大鼠給予腹腔注射10 mg/kg

地西泮控制驚厥。于對照組大鼠腹腔注射0.9%生理鹽水。死亡大鼠及癲癇發作等級未達到Ⅳ～Ⅴ級的大鼠退出實驗。造模成功的大鼠按隨機數表法分為7個亞組（n = 5）：急性期（3 h、6 h、

1 d、2 d）、潛伏期（14 d）和慢性期（30 d、90 d）。本動物實驗經濟寧醫學院附屬醫院倫理委員會批準（批件號：2023-04-B002）。

2. 細胞培養

BV2細胞及C8細胞使用含有4 500 mg/L葡萄糖、1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養基在5%二氧化碳、37 ℃下培養。將細胞接種于6孔板中直至細胞密度達到70%～80%。實驗組BV2細胞及C8細胞用含1 mmol/L H2O2的DMEM處理3 h、6 h、12 h、24 h，對照組細胞用等體積的DMEM處理。本研究所有細胞實驗均進行3次。

3. 蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白的表達

TLE大鼠中TRPM2的表達以及H2O2誘導的BV2細胞中TRPM2、PARP-1、p-NFκB-p65的表達：根據全細胞裂解試劑盒（KeyGEN BioTECH）的說明書提取TLE大鼠海馬以及BV2細胞的蛋白進行定量。上樣分離、轉移、封閉后于4℃與一抗孵育過夜，洗滌，將膜與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗在室溫中孵育1 h。使用超敏ECL蛋白印跡檢測試劑顯示免疫反應帶。用ImageJ軟件進行半定量分析。

4. 免疫熒光染色

組織切片復溫后用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，孵育、封閉、移除封閉液后與TRPM2抗體以及Iba-1抗體在4℃孵育過夜，洗滌，室溫與山羊抗兔IgG 和山羊抗小鼠IgG孵育1 h，洗滌，用DAPI染色15 min，洗滌后封片。采用LSM800共聚焦顯微鏡進行圖像采集。

5. ELISA檢測細胞培養基炎癥因子表達情況

上述細胞離心后取培養基，按照說明書用ELISA試劑盒檢測其中的IL-1β、IL-1及TNF-α，根據標準品的濃度與檢測結果計算出待測樣品中各細胞因子濃度。

6. CaN活性檢測

用CaN檢測試劑盒檢測H2O2誘導的BV2細胞中CaN活性，在平板掃描儀660 nm處測定吸光度。CaN活性的定義為CaN以1 mg蛋白/分鐘釋放的游離磷酸鹽量。

三、統計學處理

采用GraphPad Prism 8進行統計分析。實驗數據均符合正態分布，以表示。多組間比較采用單因素方差分析，多重比較使用Dunnett-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、TRPM2在癲癇組大鼠海馬中呈動態表達

急性期（2 d）癲癇組大鼠海馬中TRPM2表達升高（P < 0.05）；而潛伏期和慢性期（14 d、30 d、90 d）TLE大鼠海馬中TRPM2的表達與對照組比較差異無統計學意義。見圖1。

二、TRPM2在癲癇組大鼠海馬中的細胞定位

免疫熒光結果顯示，TRPM2在對照組和癲癇組大鼠海馬中與Iba-1和GFAP共表達，表明TRPM2在對照組和癲癇組大鼠海馬的星形膠質細胞和小膠質細胞中均有表達。與對照組相比，癲癇組中小膠質細胞處于激活狀態，表現為小膠質細胞增多、遠端突觸減少、突觸增粗、胞體變大、Iba-1熒光強度增強，同時，TRPM2在活化的小膠質細胞中的表達較多。癲癇組中星形膠質細胞胞體增大、突觸變多、增粗、熒光強度增強，表明癲癇組海馬中星形膠質細胞激活，且TRPM2在激活的星形膠質細胞中的表達較多。見圖2。

三、TRPM2在H2O2誘導的C8和BV2細胞中的表達

蛋白免疫印跡結果顯示，H2O2誘導的BV2細胞及C8細胞中TRPM2表達量均較對照組高（PBV2 12 h<

0.01；PBV2 24 h <0.001；PC8 6 h <0.05；PC8 12 h <0.05；PC8 24 h <

0.01），且表達量隨H2O2刺激時間的延長而增加。見圖3。

四、H2O2誘導的BV2和C8細胞中促炎細胞因子的表達

采用ELISA檢測H2O2誘導的BV2和C8細胞分泌促炎細胞因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的水平。結果顯示，隨著H2O2刺激時間的延長，BV2細胞釋放IL-1β、IL-6及TNF-α的水平增加（PIL-1β 3 h <

0.05；PIL-1β 12 h <0.01；PIL-1β 24 h <0.001；PIL-6 24 h <0.05；PTNF-α 3 h <0.01；PTNF-α6 6 h <0.001；PTNF-α 12 h <0.001；

PTNF-α 24 h <0.001）。C8細胞釋放IL-1β和IL-6的水平也增加（PIL-1β 12 h <0.05；PIL-1β 24 h <0.05；PIL-6 24 h <0.01），而TNF-α的含量與對照組比較差異無統計學意義。見圖4。

五、PARP-1、TRPM2、GSK-S9、GSK以及p-NF-κB p65在H2O2誘導的BV2和C8細胞中的表達

用H2O2誘導BV2和C8細胞系來模擬癲癇發作時氧化應激對小膠質細胞和星形膠質細胞的影響。結果顯示，隨著H2O2誘導時間的延長，BV2細胞中PARP-1、TRPM2和p-NF-κB p65的表達逐漸增加（PPARP-1 6 h <0.01；PPARP-1 12 h <0.001；PPARP-1 24 h<0.001；PPARP-1 6 h <0.01；PTRPM2 12 h <0.01；PTRPM2 24 h<0.001；

Pp-NF-κB p65 12 h <0.001；Pp-NF-κB p65 24 h <0.01），GSK-3β/GSK的比值下降、GSK的活性增加（PGSK-3β/GSK 12 h <0.05；PGSK-3β/GSK 24 h <0.001），見圖5。在H2O2誘導的C8細胞中，TRPM2表達及GSK的活性也增加（PTRPM2 6 h <

0.05；PTRPM2 12 h <0.05；PTRPM2 24 h<0.01；PGSK-3β/GSK 6 h <

0.001；PGSK-3β/GSK 12 h <0.001；PGSK-3β/GSK 24 h < 0.001），而PARP-1以及p-NF-κB p65的表達與對照組比較差異無統計學意義。見圖6。

六、H2O2誘導的BV2細胞中CaN活性的測定

結果表明，H2O2誘導的BV2細胞中CaN的活性隨著H2O2刺激時間延長而增加，在12 h、24 h時增加具有統計學意義（P12 h < 0.01；P24 h < 0.01）。見圖7。

討論

TRPM2已被證實參與癲癇相關認知功能障礙的發生，并在癲癇相關神經炎癥中發揮作用［12， 19］。本研究明確了TRPM2在急性期TLE大鼠海馬中表達升高，進一步驗證了TRPM2與TLE發生密切相關。TRPM2對氧化應激刺激高度敏感，TLE大鼠海馬中TRPM2表達升高可能會增加海馬對氧化應激的易感性，更易受到癲癇發作引起的氧化應激的損傷，促進癲癇相關神經炎癥的發生。有研究表明，敲除TRPM2并不影響匹羅卡品誘導癲癇點燃［12］。據此，本研究團隊推斷TRPM2可能參與了匹羅卡品誘導的初始腦損傷的發生以及大鼠腦內癲癇灶的形成。

TRPM2離子通道介導的氧化應激和炎癥反應在多發性硬化、缺血性腦卒中、創傷性腦損傷和阿爾茨海默病等多種神經系統疾病中發揮作用［20-24］。Hu等［12］的研究顯示，敲除TRPM2可抑制匹羅卡品癲癇小鼠中小膠質細胞和星形膠質細胞的激活，并降低癲癇小鼠海馬中IL-1β、TNF-α、趨化因子配體2（CXCL2）、IL-6 mRNA的表達，但TRPM2在調節癲癇相關神經炎癥中的具體作用仍需進一步研究。本研究顯示TRPM2在癲癇大鼠海馬小膠質細胞和星形膠質細胞中均有表達，因此本研究團隊進一步利用H2O2刺激BV2細胞及C8細胞來模擬癲癇反復發作引起的氧化應激對小膠質細胞和星形膠質細胞的影響，結果顯示H2O2可激活BV2細胞及C8細胞中的TRPM2并產生促炎細胞因子?，F認為，氧化應激可通過加重神經炎癥促進癲癇的發生，因此推測氧化應激可上調小膠質細胞及星形膠質細胞TRPM2的表達，增加膠質細胞對氧化應激的易感性，并通過TRPM2介導小膠質細胞中促炎細胞因子的產生，進而促進TLE的發生發展［25］。

TRPM2在中樞神經系統中表達最高，并且在小膠質細胞中富集，其激活被證實可以刺激炎癥反應［26］。Raghunatha等［27］發現小膠質細胞N-甲基-D-天冬氨酸受體通過PARP-1/TRMP2信號驅動促炎癥反應。本研究顯示，在H2O2刺激的BV2細胞中，PARP-1、TRPM2和p-NF-κB p65的表達升高，GSK-3β及CaN活性升高，推測癲癇反復發作時，氧化應激可能通過促進小膠質細胞中PARP-1的產生激活TRPM2離子通道的開放，導致Ca2+內流，并通過CaN/GSK-3β/NF-κB p65引發一系列促炎細胞因子的產生，最終加重神經炎癥反應，促進癲癇的反復發作。與小膠質細胞相比，H2O2刺激的C8細胞分泌促炎細胞因子的能力較弱，且PARP-1、p-NF-κB p65在C8細胞中的表達水平無明顯變化，據此認為，TRPM2可能主要在小膠質細胞中介導癲癇相關神經炎癥的發生。

綜上所述， TRPM2在TLE大鼠海馬中的高表達使海馬更易受到癲癇發作時氧化應激的影響，并可能在小膠質細胞中通過TRPM2/CaN/GSK-3β/p-NF-κB p65通路參與癲癇相關神經炎癥的發生，從而促進癲癇的反復發作。本研究結果提示小膠質細胞中的TRPM2可能是TLE治療的一個新靶點，接下來將進一步明確小膠質細胞中TRPM2/CaN/GSK-3β/p-NF-κB p65通路在TLE中的作用，并深入探討星形膠質細胞的TRPM2在癲癇中的作用機制。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2023-11-04）

（本文編輯：洪悅民）