苦蕎白粉病病原鑒定及其系譜分析*

李梅方，唐國文，劉正杰，王 一，李成云，董玉梅**

(1.云南農業大學，云南省生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

白粉菌是子囊菌門(Ascomycota)盤菌亞門(Pezizomycotina)錘舌菌綱(Leotiomycetes)白粉菌目(Erysiphales)真菌的統稱，是一類分布廣泛的專性寄生植物病原菌[1-2]。常引起重要的植物病害，在全球范圍內感染超過10 000種雙子葉和單子葉植物，涉及約900 種具有重要經濟價值的農作物[3-5]。白粉菌嚴格地專性寄生于活體植物，在寄主植物上完成生長和繁殖，目前仍不能通過人工培養，其寄主范圍的變化直接導致生態位分離，從而可能觸發誘發白粉菌的新物種形成[6]。

苦蕎(Fagopyrum tataricum)為蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)一年生或多年生雙子葉植物[7]，截至目前已有22 個種[8-9]?？嗍w為蕎麥栽培種之一，在中國主產于西北、東北、華北和西南一帶高寒山區[10]。據《中國農村統計年鑒》統計，2017 年全國苦蕎年產量達到5.39×105t，種植面積和產量均居世界第1 位，是重要的糧食作物[11]。自2018 年以來，在云南農業大學蕎麥實驗種植區和云南蕎麥種植區一直觀察到白粉病，嚴重時基本絕收。本研究通過形態鑒定以及核糖體基因內轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)和核糖體大亞基(ribosomal large subunit，LSU)序列分析，明確苦蕎白粉病的病原類型及分類地位，為防治苦蕎白粉病提供依據，也為大田作物布局時避開白粉菌跨寄主的近距離接觸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集與保存

從云南農業大學試驗地采集苦蕎白粉病病葉，將病葉裝入自封袋置于冰盒中帶回實驗室，用于形態觀察及和分子生物學試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間癥狀調查

觀察記錄植株發病部位、病斑顏色和大小、危害程度等[12-13]。

1.2.2 病原菌形態觀察及致病性檢測

參考BRAUN 等[3]、KIRK 等[14]以及《中國真菌志》[15]對白粉菌無性型進行形態學分類。在數碼顯微鏡Smart zoom 5 (廣州行真科技設備)下觀察病葉的白粉菌分生孢子形態特征，測量大小并拍照；用掃描電子顯微鏡FlexSEM 1000 (日立高新技術設備)觀察分生孢子形態、著生方式及表面形態特征。

按照科赫法則測定白粉菌的致病性并進行確認[16]。將苦蕎感染葉片打成直徑6 mm 的葉盤，置于5 周齡健康苦蕎葉片正面和背面，葉盤上含有大量孢子，各接種5 株植物；將接種植株置于20～25 ℃、相對濕度80%、光照周期12 h∶12 h的溫室培養，將5 株未接種的對照植株種植于相同環境條件的另一個生長室中，用聚乙烯袋罩住處理和對照植株48 h，觀察發病癥狀和病原菌形態。

1.2.3 病原菌ITS、LSU 片段的PCR 擴增和測序

將病菌樣本帶回實驗室，用Chelex-100 法提取白粉菌DNA[17]，利用真菌通用引物ITS 和LSU進行PCR 擴增(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[18]；LROR：5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′；LR5：5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)[19]。PCR 反應體系為25.0 μL，包括2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 補足體系。PCR 擴增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃15 s，72 ℃ 30 s，循環32 次；72 ℃ 5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收備用。參照pTOPO-Blunt Simple 平末端載體試劑盒說明書與TreliefTM5α 感受態細胞連接轉化，菌液用PCR確定陽性克隆后送至擎科生物有限公司測序。

1.2.4 數據分析

在GenBank 上對測序序列進行BLAST 序列比對；為比較不同寄主白粉菌的系統發育關系，從GenBank 中下載相似性高于97%的ITS 片段，采用MEGA 7.0 軟件對序列進行最大似然法系統發育分析，進行1 000 次重復的BS 分析，構建進化樹[20]。

2 結果與分析

2.1 苦蕎白粉病田間癥狀

苦蕎白粉病發病早期，主要在病葉背面出現不規則的白色粉塵狀菌落，葉面出現褪綠小點；隨著病情發展，菌落變得豐富，覆蓋整個葉片背面，并且在葉正面也形成白色菌斑，繼而葉片正面失綠黃化，嚴重時可危害花和果實。感病葉片輕者褪綠、黃化、卷曲、皺縮，嚴重時葉片畸形、質地變硬、失去光澤、干枯(圖1)。

圖1 苦蕎白粉病癥狀Fig.1 Powdery mildew symptoms in tartary buckwheat

2.2 苦蕎白粉菌的形態特征及致病性

苦蕎白粉菌分生孢子呈圓筒形或橢圓形，無色，透明，兩端圓，單胞，表面有皺紋；長28.0～50.9 μm，寬 11.3～19.9 μm，平均大小為39.1 μm×15.3 μm (n=100)(圖2)。根據形態特征初步將病原菌鑒定為子囊菌門(Ascomycota)白粉菌目(Erysiphales)白粉菌屬(Erysiphe)真菌[16]。

圖2 顯微鏡(a)和電鏡(b 和c)下的苦蕎白粉菌分生孢子Fig.2 Conidia of powdery mildew collected from tartary buckwheat under microscope (a) and electron microscope (b and c)

苦蕎健康葉片接種病原7 d 后，在接種植株上觀察到與田間感病植株一致的癥狀，而對照植株則無發病癥狀(圖3)。接種發病葉片病原菌再經顯微觀察表明：其菌落形態及分生孢子形態特征與采集的苦蕎白粉病病原一致，表明接種的病原菌為苦蕎白粉病的致病菌。

圖3 苦蕎白粉菌的致病性Fig.3 Pathogenicity of tartary buckwheat powdery mildew

2.3 基于ITS 和LSU 片段的苦蕎白粉病菌系統進化分析

2.3.1 苦蕎白粉病菌的分子鑒定

苦蕎白粉病病原菌ITS 片段為607 bp (MW-494930.1)，LSU 片段為910 bp (OK490143)，將序列在GenBank 中進行比對，ITS 結果顯示該序列與甜蕎上的白粉菌(E.polygoni，KP076437.1)核酸序列的相似度為100.00%；LSU 結果顯示該序列與酸模上的白粉菌(E.polygoni，MT36176-9.1) 核酸序列的相似度99.89%。從GenBank 獲得76 條序列相似性高于97%的ITS 片段，以E.glycines序列 (LC028953.1)為外群，經多序列比對后獲得550 bp 的矩陣，構建的系統發育樹(圖4)顯示：病原菌的ITS 序列與E.polygoni聚為一支。從GenBank 檢索相似性高于97%的LSU 序列，共獲得57 條注冊為白粉菌的序列，以E.glycines序列 (AB015927.1)為外群，經過對位排列后獲得792 bp 的矩陣，構建的系統發育樹(圖5) 顯示：病原菌的LSU 序列與E.polygoni聚為一支。結合病原菌致病性測定、形態特征以及ITS 和LSU 序列比對，將苦蕎白粉病病原菌鑒定為蓼白粉菌(E.polygoni)。

圖4 基于77 條白粉菌序列 ITS 區域的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the ITS regions of 77 powdery mildew sequences

圖5 基于59 條白粉菌 LSU 區域的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the LSU regions of 59 powdery mildew sequences

2.3.2 苦蕎白粉病菌在白粉菌系譜中的位置

76 條序列包含5 種已命名的白粉病病原菌，寄主來源涵蓋7 科26 屬植物(表1)，E.polygoni、E.heraclei、E.buhrii和E.betae占主要部分。E.polygoni寄主均為蓼科植物；E.heraclei序列占比最多，寄主植物包括傘形科、五加科和蓼科的16 屬植物，其中傘形科植物占83%；E.buhrii寄主為石竹科；E.betae寄主為藜科和莧科植物，且與E.heraclei在系譜發育樹上交替分布。相似性高于99%的序列中包含E.polygoni和E.heraclei2 個種；當相似性大于98%時，新增加E.buhrii和E.betae2 個種；當相似性大于97%時，又新增加E.pisi1 個種?；贗TS 基因片段構建的系統發育樹(圖4)顯示：在第4 個節點處將序列分為2 個大分支，本研究病原菌與來自蓼科的E.polygoni(KP076437.1)相似性為100.00%，與13 個E.polygoni和1 個E.heraclei的相似性都大于99%。該分支的寄主均為蓼科，且強烈聚為1 個分支。該分支又分為2 個小分支，1 個小分支寄主為蕎麥屬、大黃屬和酸模屬，其中酸模屬居多；另1 個小分支寄主為蓼屬、竹節蓼屬和珊瑚藤屬，其中竹節蓼屬和珊瑚藤屬各有1 種，其余為蓼屬植物。

表1 GenBank 中檢索到的相似性高于97%的白粉菌ITS 序列及其寄主信息Tab.1 Host information and ITS sequence similarity (≥97%) retrieved from GenBank

57 條LSU 序列包含21 種白粉病病原菌，寄主來源涵蓋22 科29 屬植物(表2)。其中也檢索到E.polygoni和E.heraclei2 個種的LSU 序列，E.polygoni的寄主為蓼科植物，E.heraclei的寄主為傘形科植物?？嗍w白粉菌序列與E.polygoni、E.heraclei在同1 分支，具有較好的支持率，與ITS序列進化樹相似。相似性高于99%的序列包括E.polygoni和E.heraclei2 個種；當相似性大于98%時，增加E.trifoliorum、E.cruciferarum、E.ac-antholimonis、E.quercicola、E.convolvulivar.、E.berberidis和E.magnifica7 個種；當相似性大于97%時，增加E.alphitoides、E.convolvuli、E.lespedezae、E.limonii、Pseudoidium neolycopersici、E.corylacearum、E.caricae-papayae、E.aquilegiae、E.takamatsui、E.platani、E.aquilegiaevar.和E.cornicola12 個種。E.quercicola序列占比達47%，寄主包括蕓香科、大戟科、漆樹科和蓼科。

表2 GenBank 中檢索到的高相似性白粉菌LSU 序列及其寄主信息Tab.2 Host information and highly similarity of LSU sequences retrieved from GenBank

3 討論

白粉菌是最常見和最重要的專性寄生性植物病原真菌[21]，有超過400 種白粉菌能夠侵染近10 000 種植物，其中包括許多具有重要經濟價值的農作物和觀賞植物[22-24]。本研究通過致病性測定、形態學及分子鑒定，證實供試苦蕎白粉病病原為E.polygoni，該種于1986 年在中國臺灣被發現，根據形態學和寄主植物將其鑒定到種[25]。

白粉菌具有專性活體營養性質，其中既有寄主?；院芨叩姆N，也有寄主范圍較廣的種。由于迄今尚不能人工培養，僅有部分白粉菌進行過分子系統發育的相關分析[26]。根據分子鑒定結果，ITS 進化樹的E.polygoni分支中有E.heraclei(KX-757832.1)，與E.polygoni的寄主同為蓼科植物，E.buhrii的寄主為石竹科植物，而傘形科和蓼科均屬于石竹亞綱。在GenBank 中檢索到E.polygoni的相關序列45 條，寄主分別是蓼科、藜科和豆科植物，涵蓋10 屬，其中，蓼科酸模屬和蓼屬最多，豆科豇豆屬和藜科甜菜屬次之。有研究報道：東南亞、印度和澳大利亞地區E.polygoni侵染綠豆[Vigna radiata(Linn.) Wilczek]引起綠豆白粉病[27]，美國西部地區E.polygoni侵染甜菜(Beta vulgarisL.)引起白粉病[28]，可見，E.polygoni不僅只侵染蓼科植物，但其優勢寄主為蓼科植物。LSU 序列進化樹中，苦蕎白粉菌序列與E.polygoni(MT361769.1)、E.heraclei(MK966309.1)序列的親緣關系最近，但E.heraclei寄主為傘形科植物，可見，白粉菌寄主專性范圍可跨越2 個科以上的植物。隨著分子生物學的發展，對白粉菌的研究更加深入，越來越多的研究表明白粉菌的寄主跨越事件，如BEENKEN[29]報道臭椿(Ailanthus altissima)上的E.platani和E.alphitoides，宿主跳躍、跨越了不同科甚至不同目的植物，分別從懸鈴木科(Proteales)和殼斗科(Fagales)擴展到苦木科(Sapindales)，由此可見，寄主植物在綱、目、科、屬的分類階元對白粉菌的系統進化和生理進化、物種形成起著十分重要的作用。根據寄主范圍、交叉接種和多個分子標記的聯合系譜分析才能為白粉菌種群劃分、寄主范圍確定及病害有效防控提供準確的理論依據。

4 結論

本研究通過病原菌致病性測定、形態特征以及ITS 和LSU 序列比對，確定引起苦蕎白粉病的病原菌為蓼白粉菌(E.polygoni)，該病原菌有多個科寄主植物，是典型的復合種，急需從寄主范圍、交叉接種和多個分子標記的聯合系譜進行深入分析，才能為種群劃分、寄主范圍的確定以及白粉病的綠色防控提供理論依據。