小麥SUS 基因家族鑒定與生物信息學分析*

孔斌雪，李 娜，馬靖福，竇佳欣，陳 濤，張沛沛，劉 媛，楊德龍,**

(1.甘肅農業大學 生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

蔗糖是光合作用的產物，其作為最初的能量供體與植物生長發育的各種代謝途徑相關，對植物生長發育至關重要[1-2]。蔗糖參與調節細胞分裂、種子萌發、開花誘導、花青素合成、果實發育等一系列生理代謝過程[3]。蔗糖代謝研究對于了解植物生理具有重要意義。蔗糖合成酶(sucrose synthase，SUS)是植物體內調節蔗糖代謝的重要酶之一，在蔗糖運輸到庫器官之前將其分解[4]，首先在小麥胚芽中被發現[5]。SUS 在植物代謝過程中具有關鍵作用，其活性與庫強度、生物量積累以及碳分配相關[2]。研究發現：SUS 活性可影響水稻籽粒大小及產量[6]；玉米sh1突變體和豌豆rug4突變體胚乳的SUS 活性與野生型相比均有所下降，表現出籽粒干癟和粒質量下降[7-8]；擬南芥SUS基因突變體葉片和莖中的SUS 活性與野生型相比下降15%[9]；SUS 受到RNAi 抑制后，馬鈴薯塊莖中的淀粉含量降低，導致干質量下降，番茄中的蔗糖卸載能力也降低，座果數下降[10-11]。除參與廣泛的代謝過程外，SUS 還與非生物脅迫響應相關。研究發現：SUS基因的轉錄水平隨著氧氣含量的降低而增強[12-14]。SUS 也在熱應激條件下植物的生理代謝中發揮作用[15-16]。

在高等植物中，SUS 由1 個小的多基因家族編碼。前人對多種植物的SUS基因家族成員進行了鑒定和研究，結果顯示：擬南芥(Arabidopsis thaliana)[17]、水稻(Oryza sativa)[13]、煙草(Nicotiana sylvestris)[18]和巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)[19]有6 個SUS基因家族成員，石榴(Punica granatum)[20]和葡萄(Vitis vinifera)[21]有5 個SUS基因家族成員，亞洲棉(Gossypium arboreum)有7 個SUS基因家族成員[22]，楊樹(Populus trichocarpa)有15 個SUS基因家族成員[23]。前人對SUS基因家族的研究發現：SUS基因遵循基因家族進化，表現為結構保守但功能分化[24]。

小麥(Triticum aestivumL.)是全球最重要的糧食作物之一[25]，其產量受灌漿速率和灌漿持續期的影響[26]。小麥籽粒灌漿是蔗糖等光合產物向庫器官運輸的過程[27]，是決定粒質量、產量和品質的重要時期。目前，僅有少數小麥SUS基因被鑒定，TaSUS1、TaSUS2和TaSUS3在發育的籽粒中表達，在整個小麥主要灌漿期均檢測到TaSUS的轉錄本[28-29]。研究還發現：水稻籽粒胚乳的SUS活性決定水稻籽粒庫強，對水稻籽粒灌漿過程起調節作用[30]，這表明小麥SUS基因家族在調節籽粒灌漿和產量方面可能起關鍵作用。本研究利用小麥全基因組序列信息鑒定小麥SUS基因家族成員，并對其生物信息學特征進行分析，為進一步研究小麥SUS基因家族調節植物生長發育，特別是在籽粒發育中的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 小麥SUS 基因家族成員的鑒定與系統發育分析

從Ensemble Plants 數據庫[31]下載小麥全基因組數據、蛋白質序列和注釋文件，鑒定小麥SUS基因家族的成員。從PFAM 數據庫[31]下載SUS保守結構域HMMER 文件(PF00862)，并將其作為查詢序列用于搜索小麥蛋白數據庫中的SUS基因家族成員(閾值≤1×10-10)。為了保證數據的準確性，進一步通過NCBI-CDD、Inter Pro 和SMART 數據庫[32-34]驗證其是否具有SUS 結構域。根據上述結果，剔除重復基因和不含SUS 結構域的基因，然后使用MEGA 軟件[35]對擬南芥、水稻和小麥SUS基因家族蛋白序列進行多重序列比對，構建系統發育樹，并在EvolView[36]網站美化系統進化發育樹。

1.2 小麥SUS 基因的染色體定位與序列分析

利用Ensembl Plants 數據庫獲得TaSUS基因在染色體上的位置，利用TBtools 軟件進行定位。利用 MEME Suite 在線工具[37]分析TaSUS基因家族成員的保守結構域，參數motif 數量設置為10，使用 TBtools 軟件繪制基因結構圖和motif 圖。利用TBtools 軟件提取TaSUS基因編碼區上游2 000 bp序列，并提交到PlantCARE 數據庫[38]確定順式作用元件的種類和數量。通過ExPASY 在線工具[39]預測最終得到的TaSUS基因家族成員的等電點和分子質量。亞細胞定位通過Gpos-mPLoc 在線工具[40]進行預測。

1.3 小麥SUS 基因復制及共線性分析

片段復制和串聯重復對基因家族擴張非常重要[41]，為分析不同物種間SUS基因家族的共線性，從Ensemble Plants 數據庫[31]下載不同物種的基因組信息，并采用TBtools 中的One Step MCScanX 模塊進行共線性分析以及可視化。

1.4 小麥SUS 基因的表達模式分析

從小麥表達數據庫expVIP[42]下載小麥品種中國春的表達數據，分析TaSUS基因在其籽粒、根、莖、葉和穗5 個不同組織的轉錄水平?；虮磉_量熱圖利用TBtools 軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 TaSUS 基因家族成員的鑒定與命名

從小麥全基因組中鑒定到24 個SUS基因(表1)，命名為TaSUS1～TaSUS24。小麥SUS 蛋白質氨基酸數量在560～1 074 之間，分子質量為63.61～118.27 ku，理論等電點為5.69～8.69，除Ta-SUS2、TaSUS4、TaSUS6、TaSUS19、TaSUS21和TaSUS24 外，其他TaSUS 蛋白質的等電點都小于7，呈酸性。亞細胞定位預測分析表明：除TaSUS17 和TaSUS22 位于細胞質和細胞膜外，其他TaSUS 蛋白均位于細胞質。TaSUS基因家族成員均含有SUS 結構域。

表1 小麥SUS 基因家族的理化性質Tab.1 Physicochemical properties of SUS gene family in wheat

2.2 TaSUS 基因的系統進化

由TaSUS基因與6 個擬南芥AtSUS基因、6 個水稻OsSUS基因的蛋白序列構成的系統發育樹(圖1)可知：SUS基因家族可被分為3 個亞家族。其中，Ⅰ類基因20 個，包括擬南芥基因4 個、水稻基因4 個和小麥基因12 個；Ⅱ 類基因13 個，包括擬南芥基因2 個、水稻基因2 個和小麥基因9 個；Ⅲ 類基因只包含3 個小麥基因。部分小麥SUS基因家族成員與水稻的遺傳關系比其與擬南芥更密切。

圖1 小麥、擬南芥和水稻SUS 基因家族的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of SUS gene family in wheat,Arabidopsis and rice

2.3 TaSUS 蛋白保守結構域及基因結構

由圖2 可知：每個TaSUS 蛋白序列都包含多個(4～10 個)保守基序(motif)，其中motif1、mo-tif2、motif3 和motif8 保守分布于TaSUS 蛋白序列；同屬于第Ⅲ亞組的TaSUS7、TaSUS8 和TaSUS9 的motif 較為特異，motif 長且分散。這表明同一家族中的小麥TaSUS 蛋白高度保守，并且在進化過程中，不同亞群中的成員可能發生了功能分化?；蚪Y構分析顯示：除TaSUS12基因只含有9 個外顯子外，其余基因外顯子數量為12～17個；18 個TaSUS基因具有完整的非翻譯區(untranslated region，UTR)，但TaSUS1和TaSUS12基因的3′和5′端均沒有UTR，TaSUS17、TaSUS20、TaSUS22和TaSUS23的3′端不含UTR；同一亞組的TaSUS基因結構分布相對保守。

圖2 小麥SUS 基因家族的蛋白保守基序和基因結構Fig.2 Protein conserved motif and gene structure of SUS gene family in wheat

2.4 TaSUS 基因的染色體定位和共線性

染色體定位結果顯示：除1、5 號染色體外，TaSUS基因在其他染色體均有分布，其中，4A、7A 和7D 染色體上各有3 個TaSUS基因，3、6 號染色體上僅各有1 個TaSUS基因；共線性分析鑒定出20 對片段重復基因，且7 號染色體上的片段重復基因占比最多(8 個)，每一對片段重復基因都位于相同的TaSUS亞組，且小麥SUS基因家族中不存在串聯重復基因 (圖3a)。物種間水稻、擬南芥和小麥SUS基因的共線性分析結果(圖3b)顯示：1 對TaSUS基因與AtSUS基因具有共線性，16 對TaSUS基因與OsSUS基因具有共線性，說明小麥SUS基因家族與水稻SUS基因家族親緣關系較近，可能具有相似的生物學功能。

圖3 SUS 基因家族在小麥染色體上的定位(a)以及物種間的共線性(b)Fig.3 Location on the chromosomes of wheat (a) and synteny among species (b) of SUS genes family

2.5 TaSUS 基因啟動子區的順式作用元件

TaSUS基因的啟動子區共鑒定出45 種順式作用元件，可分為激素響應元件(hormone responsive elements，HRE)、光響應元件(light responsive elements，LRE)、脅迫響應元件(stress responsive elements，SRE)、組織特異性元件(tissue specific elements，TSE)和其他響應元件(other responsive elements，ORE)(圖4)。植物激素、光響應和脅迫響應相關的元件存在于所有TaSUS基因的啟動子區，其中，激素相關的順式作用元件有生長素(auxin，IAA)、水楊酸(salicylic acid，SA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)和赤霉素(gibberellin，GA)。在小麥SUS基因家族成員中，有80%的成員都包含ABA 相關的作用元件ABRE 以及MeJA 相關的作用元件CGTCA-motif 和TGACGmotif；LRE 在24 個TaSUS基因啟動子中普遍存在；每個TaSUS基因啟動子都包含1～8 個SRE，對低溫、缺氧、干旱等脅迫做出響應；在TSE中，有RY-element、CAT-box 和GCN4_motif 順式作用元件，分別與種子、分生組織和胚乳發育相關；TaSUS基因啟動子中還包含ORE，如細胞周期調節、晝夜節律調控、玉米醇溶蛋白代謝調節和MYB 結合位點。說明TaSUS基因在調節植物生長發育中發揮著多種作用。

圖4 TaSUS 基因中的順式作用元件Fig.4 Cis-acting elements in TaSUS genes

2.6 TaSUS 基因的表達模式

由圖5 可知：大多數TaSUS基因在小麥穗中顯著表達，在葉、莖和根中的相對表達量較低，Ta-SUS3、TaSUS5和TaSUS6在小麥籽粒中顯著表達。

圖5 小麥 SUS 基因在不同組織中的表達量Fig.5 Expression levels of SUS gene in different tissues of wheat

3 討論

SUS基因家族對植物的生長發育至關重要，但鮮有小麥中SUS基因的鑒定與功能研究。本研究共鑒定到24 個TaSUS成員，明顯多于其他植物，其原因可能是小麥作為六倍體物種，基因組龐大，同源基因較多。前人研究表明：片段復制和串聯重復是植物中常見的基因復制事件，在基因家族擴展過程中扮演重要角色[43]。在鑒定到的24 個TaSUS基因中，有20 對基因存在片段復制，說明在小麥SUS基因家族擴增過程中重復事件發揮了重要作用，分析其原因可能是小麥SUS基因家族成員較多。系統發育樹分析結果表明：36 條 SUS 蛋白序列分為Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ組，這與其他植物中SUS的報道[2-3,17]一致，且Ⅰ組中的基因數量最多，Ⅲ組中不包含OsSUS和AtSUS基因，表明小麥中亞家族Ⅰ比其他基因組擴展得多。

SUS 蛋白一般是平均分子質量約為90 ku(約800 個氨基酸)的同源四聚體[2]，如水稻OsSUS1-6[13]、擬南芥AtSUS1-5[17]和石榴PsSUS1-4[20]，但其他SUS 異構體的分子質量則不同，如葡萄VvSS5 分子質量為102.7 ku[21]，擬南芥AtSUS6分子質量為106.86 ku[17]，甘蔗SoSuSy4 分子質量為106.81 ku[3]。本研究表明：大多數小麥SUS 蛋白分子質量約為90 ku，且都含有酸性氨基酸，有少數蛋白的分子質量大于100 ku，其物理化學性質與其他植物相似。已有研究表明：SUS Ⅰ和SUS Ⅱ基因有15 個外顯子，而SUS Ⅲ基因因存在3′端延伸有17 個外顯子[24]。本研究發現：小麥SUS家族基因的外顯子為 9～17 個，表明小麥進化過程中SUS基因家族外顯子存在增加或缺失。

基因表達模式分析可在一定程度上用于預測基因參與的生理過程[21,44-45]。本研究發現：大多數TaSUS基因在小麥穗中顯著表達，TaSUS3、Ta-SUS5和TaSUS6在小麥籽粒中顯著表達，表明TaSUS基因可能在調節小麥生長發育過程中發揮重要作用；TaSUS12基因雖未在小麥品種中國春的組織中表達，但其可能在其他小麥品種生長發育過程中發揮作用。SUS基因對果實發育的調節作用已在其他植物中得到證實，如：VvSS3在營養組織漿果中高表達，對調節漿果中的糖積累起關鍵作用[21]；在17 個PbrSUS基因中，有8 個在梨幼果中的表達量較高，且其表達量隨著果實的成熟逐漸降低[46]；MdSUS1.1/1.2主要在幼果和成熟果實中表達，在果實發育過程中MdSUS2.1的表達量達到最高[47]；AtSUS2在擬南芥的成熟種子中特異性表達[17]。本研究表明：TaSUS基因在小麥穗和籽粒中的表達水平高于葉、莖和根，說明SUS可能參與調節籽粒發育過程。

4 結論

本研究共鑒定到24 個TaSUS基因，可分為3 個不同的亞組。同一家族中的小麥TaSUS 蛋白高度保守，推測TaSUS基因可能參與小麥的生長發育和逆境脅迫響應。下一步研究可致力于對TaSUS基因的過表達和抑制分析，確定TaSUS在籽粒發育中的特定功能。