基于網絡藥理學探究滇黃精抗疲勞作用及其機制*

張 楠，楊 帆，馬仲帥，馬舒韻，李曦明，溫燕龍，李凌飛

(云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201)

隨著社會的飛速發展，疲勞已成為常見的健康問題，體力疲勞、心理疲勞、腦力疲勞和病理疲勞[1]會嚴重影響人們的工作效率并危害人體健康，主要表現為注意力不集中、嗜睡、情緒低落、從事正?；顒幽芰p弱、體力不支等癥狀[2]，更有甚者會增加多發性硬化癥、腦出血、神經衰弱等疾病的患病率[3]，長期疲勞會降低人體免疫力，促使病原微生物入侵機體，引發疾病[4]，過度疲勞甚至會危及生命。滇黃精 (Polygonatum kingianum) 是百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物，主要分布于云南、貴州、四川等地；其主要成分滇黃精多糖具有增強免疫能力、抗腫瘤、減緩衰老、抗炎等生物活性[5-6]，滇黃精皂苷具有降血糖、促凝血等作用[7]，滇黃精黃酮具有抗氧化、抗疲勞等作用[8-9]。盡管已有報道表明滇黃精具有抗疲勞功效，但目前對滇黃精的抗疲勞作用機制尚不清楚。

網絡藥理學于2007 年由藥理學專家ANDREW 提出，隨后應用于眾多研究領域。網絡藥理學旨在針對藥物中的某種或多種成分對某種或多種疾病進行分析，它以拓撲網絡的形式，強調藥物對信號通路進行多途徑調控，旨在改善藥物的有效性，減少其不良反應，降低新藥的研發成本和縮短藥物的研發時間[10]。近年來，網絡藥理學廣泛應用于藥物活性成分的作用機制預測研究。李非洲等[11]通過網絡藥理學分析方法探討人參養榮湯治療慢性疲勞的作用機制，發現其主要通過作用于MAPK14、NOS2、PTGS2 等多個靶點調控PI3K/Akt 信號通路發揮抗疲勞作用；高寒等[12]也利用網絡藥理學方法探究了刺五加總苷抗疲勞的潛在作用機制，發現刺五加總苷中的7 種活性成分通過作用于HSP90AA1、STAT3、VEGFA 等靶點而發揮抗疲勞作用。本研究基于藥物—靶點—途徑的研究思路，通過多平臺數據庫獲取滇黃精活性成分及其抗疲勞作用靶點，使用Cytoscape 和Venny 2.1.0 軟件構建滇黃精—活性成分—抗疲勞拓撲網絡，采用網絡藥理學分析技術及分子對接技術探索滇黃精抗疲勞的作用靶點及其機制，以期為滇黃精的抗疲勞功效提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 檢索滇黃精的活性成分

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺 (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP) 和CNKI 數據庫查詢滇黃精的活性成分。首先，使用TCMSP 數據庫，設置“Herb Name”為“滇黃精”進行搜索，導出其活性成分；其次，使用CNKI 數據庫搜尋與滇黃精活性成分相關的文獻并導出。去除上述步驟所獲得的重復活性成分，即獲得滇黃精的活性成分。在活性成分篩選時，通常需要滿足口服利用度大于30%和生物類藥性大于0.18 的條件[13]。在本研究中，雖然滇黃精中的一些化學成分(如滇黃精皂苷、薯蕷皂苷、重樓皂苷等)不滿足口服利用度和生物類藥性的條件，但相關文獻[14]報道了這些活性成分具有顯著的藥理作用，因此，也將這些成分保留作為滇黃精的活性成分。

1.2 滇黃精活性成分的靶點預測

SwissTargetPrediction 數據庫是基于已知化合物的二維和三維結構的相似度，對化合物治療靶點展開預測分析的工具。本研究通過小分子有機生物活性數據庫 (PubChem) 查詢滇黃精活性成分的分子線性輸入規范 (SMILES) 結構式，將其輸入到SwissTargetPrediction 數據庫中，并將種屬設置為“homo sapiens”，選取Probability＞0 的靶點，得到滇黃精活性成分潛在靶點的預測結果。

1.3 滇黃精抗疲勞靶點的篩選

在Disgenet (https://www.disgenet.org/search)數據庫的搜索框中輸入“Fatigue” (Name: Fatigue;CUI: C0015672::)，選擇“Summary of Gene-Disease Associations”，獲取與疲勞相關的靶點。由于1.2節中通過SwissTargetPrediction 預測得到的滇黃精活性成分作用靶點是所有疾病的靶點，因此，需借助Venny 2.1.0 軟件進一步篩選出疲勞有關靶點與滇黃精活性成分作用靶點的交集，從而獲得滇黃精抗疲勞的靶點。

1.4 建立滇黃精—活性成分—抗疲勞靶點網絡

將1.1 節和1.3 節獲得的數據導入Cytoscape v3.9.0 軟件中，構建滇黃精—活性成分—抗疲勞靶點的網絡圖，其中節點度值越大，則其節點顏色越深。

1.5 蛋白質互作網絡構建

將1.3 節篩選出的靶點上傳到String 數據庫，種群選擇為“homo sapiens”，將相互作用評分調整為最高置信度 (highest confidence)=0.9，隱藏沒有相互作用的蛋白靶點，獲得蛋白互作 (proteinprotein interaction，PPI) 網絡圖，并將所獲得的數據導出至Cytoscape 軟件。通過節點度值設置節點大小和顏色，得到PPI 網絡拓撲圖。

1.6 GO 富集分析與KEGG 通路分析

為更好地探究滇黃精抗疲勞靶點涉及的生物學過程及通路，將滇黃精抗疲勞靶點導入至DAVID 數據庫，在第1、2、3 列中分別選擇“Official Gene Symbol”“Gene List”和“Homo Sapiens”，根據P＜0.05 從獲得的數據中進一步篩選GO 富集結果和KEGG 通路。

1.7 分子對接分析

分子對接技術能直觀地顯示滇黃精活性成分與作用靶點的結合程度。從PubChem 中獲取滇黃精主要活性成分的3D 結構，導入至Open Babel 2.3.2 軟件，將文件格式轉化為PDB 格式；將關鍵靶點導入到PDB 數據庫中，得到其3D 構造的PDB 格式文件。將所獲取的活性成分和靶蛋白導入至Pymol 軟件，活性成分進行加氫處理，靶蛋白進行去水分子處理。使用AutoDock Vina 對主要活性成分與關鍵靶點進行分子對接，結合能與氫鍵個數反映了活性成分與關鍵靶蛋白結合的穩定性，結合能越低，對接的穩定性能越好；對接氫鍵數量越多，對接之后的化合物構象越穩定。

2 結果與分析

2.1 滇黃精的活性成分

通過TCMSP 和Drugbank 查詢滇黃精的活性成分，將查詢到的活性成分進行收集、整理及去除重復數據后，共獲得38 種活性成分(表1)。

表1 滇黃精活性成分Tab.1 Active ingredients of Polygonatum kingianum

2.2 滇黃精潛在抗疲勞靶點預測

通過Disgenet 數據庫查詢到730 個疲勞相關靶點，通過SwissTargetPrediction 數據庫預測得到滇黃精的所有作用靶點共129 個，使用Venny 2.1.0篩選到滇黃精的抗疲勞靶點30 個(圖1)。

圖1 滇黃精潛在的抗疲勞靶點數Fig.1 The number of potential antifatigue target of Polygonatum kingianum

2.3 滇黃精—活性成分—抗疲勞靶點網絡

由滇黃精活性成分—抗疲勞靶點的網絡圖(圖2)可知：包含35 個活性成分、66 個節點、187條邊。除滇黃精外，3′-甲氧基大豆苷元、黃芩素和β-谷甾醇3 種成分的節點顏色最深，表明它們是滇黃精抗疲勞的主要活性成分。此外，靶點的每1 個節點均有多條邊與之連接，也表明了滇黃精的抗疲勞功效是不同化合物協同作用的結果。

圖2 滇黃精—活性成分—抗疲勞靶點網絡Fig.2 The target network of P.kingianum-active ingredients-antifatigue targets

2.4 蛋白質互作分析

拓撲圖(圖3)包含22 個節點，47 條邊。滇黃精抗疲勞的關鍵靶點為表皮生長因子受體 (EGFR)、信號轉導及轉錄激活蛋白3 (STAT3)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體 (PTPN11 和JAK2)、酪氨酸激酶受體2 (ERBB2) 以及雌激素受體 (ESR1)。

圖3 蛋白互作網絡Fig.3 Protein-protein interaction network

2.5 滇黃精抗疲勞基因GO 分析

滇黃精抗疲勞關鍵靶點共涉及68 個條目。前30 個條目中(圖4)，生物學過程包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正向調節、轉錄正向調節等13個生物學過程；細胞組成包括細胞溶質、細胞核、核質等7 個組分；分子功能包含ATP 結合、蛋白激酶結合、酶結合等10 種功能。

圖4 滇黃精抗疲勞GO 富集分析Fig.4 Antiatigue GO enrichment analysis of P.kingianum

2.6 滇黃精抗疲勞KEGG 通路分析

對滇黃精抗疲勞的關鍵靶點進行KEGG 通路分析，得到的結果數據以P＜0.05 進行進一步篩選，共計得到39 個通路，其中基因富集數大于5 的通路主要包含癌癥中的蛋白聚糖、耐藥性EGFR 酪氨酸激酶抑制劑、PI3K-Akt 信號通路等10個通路(圖5)。

圖5 滇黃精抗疲勞KEGG 通路分析Fig.5 Antifatigue KEGG pathway analysis of P.kingianum

2.7 分子對接

將蛋白質互作網路篩選出的6 個關鍵靶蛋白(EGFR、STAT、PTPN11、ERBB2、ESR1 和JAK2)分別與滇黃精的3 個抗疲勞活性成分(黃芩苷元、3′-甲氧基大豆苷元和β-谷甾醇)進行分子對接，結果(表2 和圖6)顯示：滇黃精主要活性成分與關鍵靶蛋白對接的結合能均小于-5 kcal/mol，表明預測的活性成分與關鍵靶點結合性能良好。其中，黃芩苷元對關鍵靶蛋白的結合能低且結合氫鍵數量最多，表明黃芩苷元在滇黃精抗疲勞過程中發揮著重要作用。

圖6 滇黃精活性成分(黃芩苷元)與關鍵靶點分子對接的可視化圖Fig.6 Visualization of molecular docking between active ingredient (baicalein) and core target of P.kingianum

表2 分子對接結果Tab.2 Results of molecular docking

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法對滇黃精潛在的抗疲勞作用機制進行分析，結果表明滇黃精的抗疲勞作用具備多成分、多靶點的特性，且由不同的活性成分發揮抗疲勞功效。拓撲網絡分析顯示：3′-甲氧基大豆苷元、黃芩苷元和β-谷甾醇的節點最大，表明這3 種成分是滇黃精抗疲勞的主要活性成分。PPI 網絡表明：滇黃精活性成分與靶蛋白之間具有較強的互作效應，EGFR、STAT3、PTPN11、ERBB2、ESR1 和JAK2 為滇黃精抗疲勞的關鍵靶點；分子對接結果表明：滇黃精3 種抗疲勞主要活性成分均能與抗疲勞的6 個關鍵靶蛋白自發結合，且黃芩苷元的抗疲勞活性最為重要。黃芩苷元屬于黃酮類化合物，主要來源于黃芩根，研究表明其具有良好的抗炎、抗氧化、抗過敏以及抗癌的生物功效[15]，并能顯著抑制炎癥因子TNF-α 和IL-6 的表達[16]，從而緩解由炎癥因子引起的疲勞。陳景等[17]研究發現：黃芩苷元能上調大鼠海馬CA1 區超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化酶的表達，降低丙二醛含量，上調磷酸化核因子E2 相關因子2 及血紅素氧合酶1 的蛋白表達。3′-甲氧基大豆苷元為異黃酮類物質，具有鎮痛[18]、清除自由基[19]、抗炎[20]等作用。β-谷甾醇屬于植物甾醇類化合物之一，具有抗炎[21]、抗菌[22]、降脂[23]以及提高人體免疫力的作用[24]。

GO 分析表明：滇黃精的抗疲勞作用涵蓋細胞炎癥、細胞生長、能量代謝以及自由基代謝等多個生物學過程。對細胞組分的分析發現：滇黃精抗疲勞的主要作用靶點涉及胞漿、核質、線粒體、染色質等。線粒體是骨骼肌中重要的細胞器，能為骨骼肌的舒張和收縮提供能量。WANG 等[25]研究發現：Nrf2 介導的氧化應激與疲勞有關，且血紅素氧合酶1 能夠促進線粒體合成[26]，加速機體產生能量，緩解疲勞。分子功能包含了ATP 結合、蛋白激酶結合、鋅離子結合等作用。其中，鋅是人體所必需的微量元素，也作為許多酶的金屬催化劑，可通過合成RNA 聚合酶和DNA 聚合酶加速DNA、蛋白質以及膠原的合成，同時促進維生素A 的吸收、組織修復及再生，與肌肉質量關系密切[27]。此外，鋅是重要的抗氧化劑，能有效減少運動過程中機體代謝產生的自由基，尤其是在高強度的激烈運動后，適量補充鋅有利于運動后自由基的消除[28]。蛋白激酶存在于細胞質中，能夠調節人體的神經系統，對神經系統的發育、行為的形成、長期記憶等具有正向調節作用。田振軍等[29]研究證明蛋白激酶類基因可緩解運動性中樞疲勞的產生。

KEGG 通路分析表明：滇黃精抗疲勞作用主要涉及MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT 等信號通路。其中，MAPK 信號通路主要參與細胞炎癥、細胞凋亡、免疫調節、HSCs 活化增殖和生成膠原的重要調節途徑[30]。李丹等[31]通過小鼠疲勞跑臺實驗和懸尾實驗證明艾灸能夠介導JAKSTAT 的信號通路緩解疲勞。郭靜等[32]利用大黃素衍生物作用于RAW264.7 炎癥細胞，通過抑制PI3K-Akt 途徑能夠減少細胞炎癥的產生。研究表明：產生疲勞的兩大主要因素是細胞炎癥因子水平的上升以及機體內抗氧化酶的消耗和代謝物的積累[33]，因此，本研究中滇黃精抗疲勞的主要機制可能是滇黃精通過調控MAPK 通路、PI3KAkt 途徑和JAK-STAT 信號通路，降低細胞炎癥水平、加快細胞周期進程及減少代謝產物的積累，從而發揮抗疲勞作用。這些結果表明滇黃精的抗疲勞作用由多個生物學過程共同參與，同時也表明了滇黃精的抗疲勞作用是多成分、多靶點、多途徑共同參與。

4 結論

本研究通過網絡藥理學方法和分子對接探究了滇黃精的抗疲勞機制，表明滇黃精抗疲勞功效具有多成分、多靶點、多通路共同參與的特點，可通過抗炎、加速能量及自由基代謝、加速細胞周期進程等細胞生物學過程共同發揮抗疲勞作用。研究結果為滇黃精抗疲勞功效提供了理論依據。