專利中藥復方治療肝纖維化的用藥規律及機制研究

韋柳婷, 高松林, 吳凡, 王燕鳳, 何廣英, 胡振斌

(1.廣西中醫藥大學第一臨床醫學院, 南寧 530000; 2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院, 南寧 530000)

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是病毒感染、遺傳、脂肪過度沉積和藥物性損傷等各種因素導致的慢性肝損傷以及細胞外基質(extracellular matrix, ECM)過度沉積引起的病理變化,可進一步發展至肝硬化、肝衰竭、肝癌等嚴重肝病[1]。近年來,中國慢性肝病患者逐年增加,給醫療衛生帶來了沉重的經濟負擔,其中肝纖維化的發病率約占全部肝病的15%～20%[2]。目前,臨床上治療肝纖維化尚無特異性藥物,主要針對病因治療,如改變生活方式、戒酒和使用抗病毒藥物等,但是對于晚期肝纖維化患者療效欠佳,而且無法從根本上逆轉肝纖維化[3]。肝移植作為終末期肝纖維化的最終和唯一的治療選擇,受到供體短缺的限制,因此對于抗肝纖維化藥物的研發迫在眉睫。

在中醫古籍中無肝纖維化的病名記載,根據脅部腫塊、脅肋疼痛等臨床表現,可將其納入“積聚”、“脅痛”和“肝著”等范疇。中醫藥在防治肝纖維化方面具有明確的療效,如扶肝化纖湯、安絡化纖丸[4-5]。中藥專利復方是具有治療依據的有效驗方,也是新藥的重要來源,揭示專利復方治療肝纖維化的用藥規律和相關機制意義重大。數據挖掘聯合網絡藥理學方法能夠系統地闡述中藥復方的用藥及配伍規律和作用機制,是目前研究的熱點[6-7]?，F通過對治療肝纖維化的中藥專利復方進行數據挖掘,探索其中的用藥規律,運用網絡藥理學方法探討核心高頻藥對治療肝纖維化的機制,以期為肝纖維化的新藥研發和臨床用藥提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 數據來源

在國家知識產權局中國專利公布公告網(http：//epub.cnipa.gov.cn/)的高級查詢中的名稱欄目以“肝纖維化”為檢索詞搜索相關的發明公布和發明授權,檢索建庫至2023年3月10日所有治療肝纖維化的中藥專利復方。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 納入標準

專利名稱中明確指出具有治療肝纖維化作用的中藥專利復方。

1.2.2 排除標準

①僅含有單味中藥的處方;②組方重復或不明確且不能在中國知網專利數據庫補全的處方;③外用、保健品、飲品或食品類專利處方;④包含中藥單體、西藥的復方。

1.3 數據規范及數據表建立

將符合納入標準的專利復方根據《中藥學》[8]規范中藥名稱,《中藥學》中未收錄的則參照藥智網(https：//db.yaozh.com/)或保留原名。如春砂仁、荊三棱、內蒙古紫草不考慮產地的影響分別錄用為砂仁、三棱、紫草,醋柴胡、醋鱉甲和炒白術均不考慮炮制的影響分別錄入為柴胡、鱉甲和白術,地鱉蟲、蘭草、蘇條參不考慮別名的影響分別錄入為土鱉蟲、佩蘭和黨參。

1.4 數據導入與核對

將整理后的中藥錄入Excel表并導入中醫傳承計算平臺3.0(TCMICS V3.0)的“數據管理”模塊,由專人進行核查,防止出現遺漏、錄錯、重復等情況。

1.5 統計分析

通過TCMICS V3.0“方劑分析”版塊對中藥進行頻次統計、關聯規則及聚類分析,運用Excel表格對高頻藥物的性味歸經和功效進行統計分析。

1.6 網絡藥理學分析

在TCMSP數據庫(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)中以口服利用度≥30%且類藥性≥0.18為條件篩選出核心高頻藥對的有效成分及靶點,并以“hepatic fibrosis”為關鍵詞在GeneCards(https：//www.genecards.org/)、OMIM(https：//omim.org/)和TTD(https：//db.idrblab.net/ttd/)數據庫篩選出肝纖維化的靶點相映射并取交集,作為核心高頻藥對治療肝纖維化的潛在靶點。通過Cytoscape3.9.1軟件構建“中藥-活性成分-靶點”網絡并進行拓撲分析。將交集靶點導入STRING(https：//string-db.org/)數據庫中,構建蛋白質相互作用(proteinprotein interaction,PPI)網絡并篩選出關鍵靶點,應用R語言進行基因本體(gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。通過Pub Chem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、PDB(https：//www.pdbus.org/)數據庫下載核心活性化學成分、關鍵靶點的結構,結合Chem3D軟件、PyMol軟件、AutoDockTools1.5.6軟件進行預處理,運用AutoDockVina1.1.2軟件進行分子對接。

2 結果

經過初步檢索和去重后,共得到357個專利復方,再經過納入和排除篩選,最終獲得147個治療肝纖維化的專利復方。

2.1 中藥頻次統計

147個專利復方涉及431種中藥,共1 386頻次。使用次數不低于8次(5.44%～42.18%)的中藥有42味,共計750頻次,約占總頻次的54.11%,可見其為高頻藥物,如表1所示。

表1 使用頻率≥5%的中藥Table 1 Traditional Chinese medicines with frequency≥5%

2.2 高頻藥物功效統計

根據《中藥學》[8]對高頻藥物進行功效分類統計,結果可分為10類,用藥次數最多的是補虛藥,其中黃芪、甘草、白術、黨參和人參為補氣藥,補血藥有白芍和當歸,補陰藥有鱉甲和枸杞子,冬蟲夏草為補陽藥;其次為丹參、莪術、桃仁等活血化瘀類藥物,如表2所示。

表2 高頻中藥功效分類統計Table 2 Efficacy classification statistics of high-frequency drugs

2.3 高頻藥物四氣、五味、歸經統計(使用頻率大于5%的藥物)

專利復方中高頻中藥的藥性以微寒、溫、平性藥為主,無熱性藥;藥味以苦、甘和辛味為主;主歸肝、脾兩經,心經、肺經次之(圖1)。

數值為中藥頻次

2.4 高頻藥物關聯規則

運用TCMICS V3.0的“方劑分析”板塊對藥物進行關聯規則分析,設置支持度≥17和置信度≥0.9得到高頻藥物組合,其中“黃芪-丹參”“黃芪-當歸”和“黃芪-鱉甲”出現頻率均超過15%(表3),核心組方為黃芪、丹參、當歸、鱉甲、赤芍、桃仁、莪術、柴胡和甘草,網絡如圖2所示。將置信度調整為≥0.7,得到“丹參,當歸→黃芪”的置信度為0.85,“丹參→黃芪”的置信度為0.72,說明其藥物關聯情況緊密(表4)。

圖2 核心藥物復雜網絡圖

表3 高頻藥物組合Table 3 Combinations of high-frequency drugs

表4 藥物關聯規則Table 4 Drug association rules

2.5 藥物聚類分析

對147個專利復方中431味中藥進行聚類分析,在TCMICS V3.0設置聚類個數為4,結果如表5所示。

表5 藥物聚類分析Table 5 Drug cluster analysis

2.6 基于網絡藥理學分析核心高頻藥對黃芪-丹參治療肝纖維化的機制

2.6.1 黃芪-丹參活性化學成分和靶點篩選

通過TCMSP數據庫得到丹參65個、黃芪20個活性化學成分,去重后共得到76個活性化學成分,經UniProt數據庫校正后最終獲得215個靶點。

2.6.2 肝纖維化相關靶點及交集靶點的篩選

在GeneCards(Relevance score>1)、OMIM和TTD數據庫中共獲得5 222個肝纖維化靶點基因。通過R語言4.2.2的VennDiagram數據包得到179個“方藥-疾病”交集靶點(圖3)。

圖3 藥物與疾病共同作用靶點韋恩圖

2.6.3 中藥-活性成分-疾病靶點網絡構建和關鍵活性成分分析

使用Cytoscape3.9.1軟件對179個交集靶點進行中藥-化合物-疾病靶點圖的構建(圖4)。利用Cytoscape3.9.1軟件的“Network analyzer”功能,根據度值篩選排名前4名的活性成分,分別是槲皮素、木犀草素、山奈酚和丹參酮IIA(表6)。

天藍色長方形節點代表潛在靶點;紅色和綠色圓圈分別代表丹參和黃芪的有效成分

表6 度值前4的活性成分Table 6 Active ingredients in the top 4 of the degree

2.6.4 PPI網絡的構建及核心靶點的篩選

在STRING數據庫中以“Homo sapiens”“highest confidence>0.95”“hide disconnected nodes in the network”為條件對179個交集靶點進行PPI網絡構建(圖5)。通過Cytoscape3.9.1軟件分析中心性(degree centrality, DC)、介度中心性(betweenness centrality, BC)、特征向量中心性(eigenvector centrality, EC)、接近中心性(closeness centrality, CC)、網絡中心性(network centrality,NC)和局部平均連通性(local average connectivity-based method,LAC)拓撲參數,以6個數值均大于其中位數的節點為條件并進行2次篩選,得到骨髓細胞瘤病毒癌基因(myelocytomatosis viral oncogene,MYC)、轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1, AKT1)、雌激素受體1(estrogen receptor 1, ESR1)、FOS原癌基因(Fos proto-oncogene,FOS)、缺氧誘導因子1亞基α(hypoxia-inducible factor 1 alpha, HIF-1α)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53, TP53)、絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase14, MAPK14)等核心靶點(圖6)。

圖5 PPI網絡模型

圖6 PPI網絡拓撲分析核心靶點

2.6.5 GO功能富集分析

GO富集分析得到2 568個生物過程、99個細胞組成和219個分子功能,分別取前10個進行條形圖展示(圖7)。在生物過程中靶點富集在對外源性刺激、化學應激和氧化應激的反應等方面;細胞組成主要涉及膜筏、膜微區和質膜穴樣內陷等;在分子功能中核受體活性和配體激活的轉錄因子活性富集程度最高。

q是P校正后的結果

2.6.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析得到175條通路(P<0.05)如圖8所示,主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol-3-kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、糖尿病并發癥中晚期糖基化終產物及其受體(advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products, AGE-RAGE)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白細胞介素(interleukin, IL)-17、低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)、輔助性T細胞17(helper T cells 17, Th17)細胞分化信號通路等。

q為P校正后的結果

2.6.7 核心活性化學成分與關鍵靶點的分子對接

將2.6.3節度值排名前4的活性化學成分(槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹參酮IIA)與2.6.4節度值排名較前的核心靶點(MYC、STAT3、AKT1、ESR1、FOS、HIF1A、TP53、MAPK14)進行分子對接,結果顯示對接的最低結合能均≤-20.93 kJ/mol,具有較好的結合活性(表7)。其中丹參酮IIA-ESR1、丹參酮IIA-FOS和木犀草素-STAT3的最低結合能均≤-37.68 kJ/mol,PyMol軟件展示如圖9所示。

圖9 部分活性成分和關鍵靶點分子對接圖

表7 分子對接結果Table 7 Molecular docking results

3 討論

3.1 用藥頻次分析

用藥頻次結果顯示黃芪、丹參、鱉甲和當歸等使用頻次較高。黃芪,味甘入脾,擅長補氣升清,能通行表里、臟腑、三焦諸氣,氣行則血行,在治療肝纖維化的專利復方中使用頻率高達42.18%,與肝纖維化氣虛血瘀的病機密切相關[9]。黃芪有效成分黃芪甲苷可通過調節N-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)等蛋白的表達,減少ECM沉積而起到抗肝纖維化的作用[10]。黃芪總皂苷對肝纖維化有顯著的干預作用,可能是通過下調賴氨酰氧化酶樣蛋白1的表達,抑制膽管反應來實現的[11]。丹參作用平和,具有活血止痛、祛瘀生新等功效。丹參多酚酸鹽能夠抑制TGF-β1/母體抗生物皮膚生長因子同源物(small mothers against decapentaplegic, Smad)、PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和神經源性基因位點切口同源物蛋白1(neurogenic locus notch homolog protein 1, Notch1)/發狀分裂相關增強子1(hairy and enhancer of split1, Hes1)信號通路,減少ECM的合成和纖維組織生成及過量沉積,減輕肝纖維化[12-13]。丹參素能夠通過抗氧化應激和炎癥反應來發揮抗肝纖維化效果,可能與核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)/抑制子κBα(inhibitor of NF-κB, IκBα)信號通路有關[14]。鱉甲咸寒質重,入肝腎經,擅于軟堅散結,常用于治療癥瘕積聚,脅下痞硬成塊等疾病。以鱉甲為主要成分的中藥制劑在治療肝纖維化方面具有較好的效果,如復方鱉甲軟肝片、鱉甲煎丸和鱉甲育肝顆粒等[15-17]。鱉甲提取物可以抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)的活化增殖和ECM合成來防治肝纖維化[18]。當歸質地甘溫而潤,善于補血活血化瘀,被譽為活血行瘀之要藥。歐當歸內酯A可能通過抑制脂質過氧化、修復內皮細胞損傷和降低一氧化氮的釋放水平來改善肝纖維化[19]。

3.2 高頻藥物功效、性味歸經分析

按功效分析,抗肝纖維化的高頻中藥可分為10類,其中以補虛類、活血化瘀類和清熱類為主,由此可反向推測出肝纖維化的病機以虛為主,與瘀、熱等因素密切相關。高頻藥物中使用頻次最高的為補虛藥(272次),且補虛藥中又以補氣和補血藥為主,如黃芪、甘草、白術、白芍和當歸等,表明了治療肝纖維化的核心在于補益,尤重補益氣血。在藥物性味歸經方面,高頻中藥藥性以微寒、溫和平性為主,藥味以苦、甘和辛味為主,主歸肝脾兩經,心經、肺經次之,由此可知肝纖維化病機與五臟相關,肝脾尤甚,治療時應注重寒溫并用、辛開苦降、肝脾同調。

3.3 組合頻次及關聯規則分析

藥物關聯規則顯示復方中藥常用的藥對有黃芪-丹參、黃芪-當歸、黃芪-鱉甲等,高頻角藥有黃芪-丹參-當歸。這些藥對與角藥多為補氣藥與補血、活血化瘀藥相結合,均為臨床上常用于治療肝纖維化的藥對?！包S芪-丹參”藥對具有益氣健脾、活血祛瘀止痛功效,研究表明,兩種藥物均可通過促進膠原降解、清除氧自由基來發揮抗纖維化作用,且合用效果優于單藥作用[20]?！包S芪-當歸”藥對可氣血雙補、活血止痛,共同作用于p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases,p38MAPK)磷酸化通路,通過減少炎癥反應來防治肝纖維化[21]?！包S芪-鱉甲”藥對既能滋補肝陰以柔肝體、補脾益氣以治其本,又能軟堅散結以治標?！包S芪-丹參-當歸”角藥中當歸為補血圣藥,黃芪善于補益脾氣,兩藥合用以補氣生血,如當歸補血湯、黃芪地黃丸等,丹參入肝經血分,既能活血止痛,又可祛瘀生新而不傷正,與歸芪相合共奏補氣養血、活血消癥、祛瘀生新之效。

3.4 藥物聚類分析

聚類分析將147首方大致分為4類,第一類核心組合以鱉甲、當歸、皂角刺、老鸛草、三七、黃芪為基礎,此組合蘊含當歸補血湯之意,當歸補血活血,黃芪健脾益氣,鱉甲、皂角刺、老鸛草散結通絡,三七化瘀不傷正,諸藥合用,共奏益氣補血,化瘀散結功效;第二類組合為黃芪、丹參、當歸、柴胡、甘草、黃芩,為逍遙散類方。方中柴胡疏肝解郁,當歸補血活血,二藥合用可補肝體而助肝用,黃芪、丹參補氣活血,黃芩清熱解毒,甘草調和諸藥,發揮補氣活血、疏肝清熱功效;第三類組合含鱉甲、紅花、黃芪、丹參、牛膝、三七,黃芪、牛膝益氣活血、補益肝脾腎三臟,紅花、丹參、三七活血散瘀,鱉甲軟堅散結,全方益氣活血,軟堅散結,可用于氣虛血瘀型肝纖維化;第四類組合為補陽還五湯化裁,有黃芪、丹參、鱉甲、甘草、赤芍、當歸,方中黃芪、當歸補氣活血,赤芍、丹參清熱活血祛瘀,鱉甲軟堅散結,甘草與諸藥調和,重在補益氣血,活血化瘀,兼以清熱散結,適用于氣虛血瘀型肝纖維化兼見熱癥。

3.5 高頻藥對黃芪-丹參治療肝纖維化的機制分析

拓撲分析得出黃芪-丹參可能是通過槲皮素、木犀草素、山奈酚和丹參酮IIA等活性成分治療肝纖維化。槲皮素是一種具有抗炎和抗氧化功能的多酚類黃酮,其改善肝纖維化和護肝的機制可能與抑制Wnt信號通路相關[22]。木犀草素是一種常見的膳食黃酮類化合物,不僅可以通過減少細胞外基質積聚和組織蛋白酶基因表達來預防纖維化,還能夠增強肝臟抗氧化系統、清除活化的HSC和抑制HSC活化,顯著改善肝纖維化[23]。山奈酚具有抗炎、抗菌和抗氧化活性,可以通過調控微小核糖核酸-26b-5p(miR-26b-5p)/鋸齒狀1(Jagged 1, Jag1)軸和神經源性基因位點切口同源物蛋白(neurogenic locus notch homolog protein, Notch)通路抑制HSC的異?；罨l揮抗肝纖維化作用[24]。丹參酮IIA能夠抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗血管生成,Xu等[25]研究發現,通過調節TGF-β1/Smad信號通路發揮改善非酒精性脂肪性肝炎相關纖維化的療效。

PPI網絡預測的關鍵靶點包含MYC、STAT3、AKT1、ESR1、FOS、HIF1A、TP53、MAPK14等。轉錄因子MYC的激活被確定為纖維化的下游驅動因素,內皮細胞GATA結合蛋白4(GATAbindprotein, GATA4)通過在染色質水平上抑制MYC激活和促纖維化血管分泌信號傳導來保護竇周肝纖維化[26]。細胞質信號轉錄因子STAT3在肝臟中的作用具有爭議性,在調節細胞存活和增殖等方面具有積極作用,然而,當其持續激活時,促炎作用會導致肝纖維化的發生和發展,在許多肝纖維化組織中可檢測到STAT3的激活[27]。AKT1可通過調節磷酸肌醇依賴性激酶-1、mTOR復合物2和PI3K等信號通路的表達,促進炎性、增殖性和纖維化基因表達上調,誘導肝纖維化的發生[28]。肝細胞和HSC中磷酸化STAT3的表達水平與重度小葉炎癥、氣球樣變和晚期纖維化相關,而彌漫性表達的ESR1與輕度纖維化相關[29]。肝竇內皮細胞降解ECM的能力與分泌型基質金屬蛋白酶的表達有關,尤其是受轉錄因子c-FOS調控的基質金屬蛋白酶9[30]。HIF1A是HIF1的一個調節亞基,是在缺氧應激中發揮關鍵作用的轉錄因子,研究發現HIF-1α可以上調HSC中IL-6的表達加重肝纖維化[31]。p53基因(TP53)是維持細胞穩態的重要調節因子,p53對肝損傷的不同階段影響不同,在p53激活的初始階段具有抗炎和抗纖維化作用,在慢性肝損傷的情況下,p53的激活和衰老會促進HSC的積累,導致肝臟疾病的發展[32]。在非酒精性脂肪性肝炎模型中,抑制MAPK14的表達能改善肝損傷和肝纖維化[33]。

KEGG通路富集分析發現黃芪-丹參主要通過PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF、IL-17、HIF-1、Th17細胞分化等信號通路治療肝纖維化。PI3K-Akt信號通路廣泛參與多種生物過程,也是影響肝纖維化、肝癌形成的重要一環,阻斷PI3K-Akt信號傳導可以改善肝纖維化,甚至是減少肝癌的發生[34]。AGE-RAGE是一組由蛋白質和脂質的非酶糖化和氧化形成的不可逆反應衍生物,能夠激活下游信號級聯(包括NF-κB、TGF-β1和活性氧)誘導氧化應激的產生,導致HSC活化,從而促進相關肝纖維化的發生發展[35]。在病毒感染、化學藥物等因素刺激下,大量TNF-α釋放出來,參與肝組織炎癥反應,同時導致大量ECM的合成與沉積,最終形成肝纖維化[36]。HIF-1可能通過介導肝臟炎癥促進非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肝纖維化的發展[37]。Zhou等[38]、孫磊等[39]研究發現,下調Th17、IL-17A表達,可抑制日本血吸蟲感染導致的肝纖維化。

4 結論

從數據挖掘層面探討中藥專利復方治療肝纖維化的常用藥物及配伍規律,可為臨床上優化處方和新藥研發提供思路。通過網絡藥理學方法預測核心高頻藥對“黃芪-丹參”治療肝纖維化的潛在機制,發現黃芪-丹參通過多成分、多靶點調控PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF和IL-17等通路來治療肝纖維化,為進一步的基礎研究提供了方向。