女貞不同部位總黃酮含量對比及其抗氧化性能研究

■ 徐瑞芳

（新鄉醫學院三全學院，河南 新鄉 453003）

女貞樹簡稱女貞（Ligustrum lucidumAit.），木犀科常綠植物，分布于華東、華南、西南及華中各地。女貞子（Fructus ligustri lucidi）為木犀科植物女貞的果實，具有補腰膝、壯筋骨、烏須發等作用，作為中藥應用已有2 000 多年[1-3]。女貞子化學成分豐富，主要包含萜類、黃酮類、揮發油及多糖等成分，其中黃酮類化合物（Flavonoids）是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結構的化合物[4-6]。研究表明，女貞子及其提取物應用于畜禽生產中，具有提高生產性能、抗氧化、提高免疫力、促進脂類代謝、抑菌抗炎、改善畜禽產品品質等功能[7-9]。

黃酮類化合物是天然的抗氧化劑，能夠抑制和清除動物機體內的不良自由基（主要來自酶促反應或非酶促反應），在生物系統中具有保護功能[10-12]。研究表明，黃酮類化合物有抗氧化、抗微生物、提高免疫力、抗炎抑菌、降血糖、調節脂質代謝和抗癌等藥理作用[13-15]；可以促進動物生長發育、提高動物產品質量，因此在動物生產中被廣泛用作飼料添加劑[16-18]。

女貞子在我國分布廣泛、資源多、價格低，它作為飼料添加劑具備無殘留、無抗藥性等特點[19]。女貞中的黃酮類物質是女貞發揮藥理活性的重要成分，其含量是鑒別評價女貞質量的標志物之一[20-21]。女貞總黃酮的研究多在女貞子黃酮含量測定及提取工藝方面，關于女貞不同部位黃酮的含量及活性是否有差異報道較少。試驗選取女貞樹的莖、葉、果實作為研究材料，采用超聲波提取總黃酮，并以其總還原能力、清除DPPH·和ABTS+·的能力來評價其抗氧化活性，研究女貞樹各部位總黃酮含量與抗氧化活性，為女貞樹資源的充分開發利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）采于新鄉醫學院三全學院內（2022 年9 月份，采集植株30 棵），并另采取女貞子（紫果）（2022 年12 月份，采樣植株同9月份）。

蘆丁，≥98%，上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸（VC），分析純，天津市大茂化學試劑廠；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），96%，上海易恩化學技術有限公司；2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽（ABTS），98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等其他試劑均為分析純。

XFB型中藥粉碎機，湖南中誠制藥機械廠；101型電熱鼓風干燥箱，上?？坪銓崢I發展有限公司；BSA224S 分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；SHZ-DⅢ循環水式多用真空泵，上海力辰邦西儀器科技有限公司；TD4 低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；R206 旋轉蒸發儀，上海申生科技有限公司；UV-1600 型紫外可見分光光度計，翱藝儀器有限公司。

1.2 總黃酮標準曲線的繪制

準確稱取蘆丁標準品0.02 g，用無水甲醇溶解定容于100 mL 容量瓶制備0.2 mg/mL 蘆丁對照品溶液。取蘆丁對照品溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL 到7 個潔凈的10 mL 容量瓶中，用50%的乙醇補充至4 mL，然后依次向其中先加入5%的亞硝酸鈉試劑0.4 mL搖勻后靜放10 min，再加入10%的硝酸鋁試劑0.4 mL并搖勻后靜放10 min，再加入4%的氫氧化鈉試劑4 mL，之后以50%的乙醇定容至10 mL，震搖后靜放15 min。用紫外可見分光光度計在510 nm，以空白溶液校零，檢測各濃度的吸光度值A。以不同的蘆丁濃度C（μg/mL）為橫坐標，各濃度的吸光度值A 為縱坐標繪圖，得到線性回歸方程。

1.3 材料預處理

將女貞葉、女貞莖和女貞子（青果）、女貞子（紫果）用清水沖洗干凈，放置于恒溫干燥箱中，70 ℃烘干至恒重，用中藥粉碎機粉碎至粉末狀態，分別放置于干燥廣口玻璃瓶中常溫保存。

1.4 超聲波提取總黃酮

超聲波是一種空化機械波，其產生的空化效應可以加速活性物質的溶出，運用超聲輔助提取天然活性物質不僅可以提高得率，還能避免因提取溫度過高而對活性物質產生的破壞作用[22-23]。參考周旋等[24]對超聲輔助提取女貞子總黃酮工藝研究方法，設計以下操作方法。

準確稱取女貞葉粉末2 g 放入錐形瓶中，以料液比1∶50（g∶mL）加入濃度為60%的乙醇100 mL，200 W，超聲90 min，4 000 r/min 離心10 min 收集上清，沉淀重復超聲一次，合并濾液，取1 mL 總濾液按照1.2 的方法測定吸光度A，帶入線性回歸方程計算女貞總黃酮的含量，用公式（1）計算得到女貞總黃酮含量（mg/g），重復3 次操作計算平均值，女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）的總黃酮提取方法及計算方式同女貞葉。

1.5 女貞各部位總黃酮粗純化

將女貞葉、女貞莖和女貞子（青果）、女貞子（紫果）總黃酮提取液分別用旋轉蒸發儀進行旋蒸，濃縮成浸膏，用蒸餾水沖洗下來。為除去其中所含的脂溶性雜質及葉綠素等干擾物質，用等量的石油醚溶液對其進行萃取，反復萃取至石油醚層無色，收集水相繼續進行旋蒸，濃縮成浸膏，再用無水乙醇溶解，移入離心管中標記為不同部位女貞總黃酮儲備液，4 ℃冰箱保存。

1.6 不同部位女貞總黃酮的體外抗氧化性試驗

1.6.1 總還原力測定方法

將純化后的葉、莖、紫果、青果黃酮溶液配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 樣品溶液。取0.4 mL黃酮溶液，加入pH 為6.6 的0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液和1%的鐵氰化鉀溶液各1 mL，混勻后50 ℃水浴20 min，冰水浴快速降溫，再加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液，搖勻，置于離心機，4 000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液中止反應，靜置10 min 后。以蒸餾水調零，于700 nm處測定吸光度，并以相同濃度的抗壞血酸（VC）做陽性對照，重復操作3次取均值。

1.6.2 女貞總黃酮對DPPH·清除作用

將純化后的葉、莖、紫果、青果黃酮溶液配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL 樣品溶液。取樣品溶液2.0 mL，加入2.0 mL 0.04 mg/mL的DPPH-乙醇溶液，混勻后放于暗處充分反應30 min，在510 nm 處檢測待測溶液吸光度記為A 樣品。以無水乙醇代替樣品溶液的吸光度值為A 空白，以無水乙醇代替DPPH 溶液的吸光度值作為A對照 ，以同濃度的抗壞血酸（VC）溶液作為陽性對照。重復3次算平均值，用公式（2）計算得到清除率，公式如下：

1.6.3 女貞總黃酮清除ABTS+·活性測定

取等體積的2.6 mmol/L 過硫酸鉀溶液和7.4 mmol/L ABTS 溶液均勻混合，室溫下避光靜置16 h 作為儲備液避光密封保存。取儲備液用蒸餾水稀釋，檢測734 nm 波長下的吸光度為0.70±0.02 即制得ABTS工作液，溶液現配現用。

將純化后的葉、莖、紫果、青果黃酮溶液配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mg/mL樣品溶液。取樣品溶液0.2 mL，加入3 mL ABTS 工作液混勻后反應15 min，于734 nm 處測定吸光度A 樣品，以蒸餾水代替樣品溶液的吸光度值為A空白，以蒸餾水代替ABTS 溶液的吸光度值作為 A 對照，以同濃度的抗壞血酸（VC）溶液作為陽性對照。重復3次算平均值，用公式（2）計算得到清除率。

1.7 數據處理與統計分析

使用Excel統計記錄試驗數據；蘆丁標準曲線、女貞各部位總黃酮含量計算采用Excel 計算分析；用SPSS 5.0 分析計算不同部位總黃酮抗氧化結果的差異顯著性及半數清除率；文中圖片均采用 GraphPad Prism 5制作。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線見圖1，方程是：y=0.012 6x+0.004 5（R2=0.998），當濃度在0.00～60.00 μg/mL 區間時，存在良好的線性關系，可以作為女貞總黃酮含量的計算公式。

圖1 蘆丁質量濃度標準曲線

2.2 女貞不同部位總黃酮提取率

女貞不同部位總黃酮超聲提取測定結果見表1，女貞不同部位總黃酮含量大小為：女貞子（青果）＞女貞子（紫果）＞女貞葉＞女貞莖。女貞樹中，女貞子黃酮含量較其他部位高，而不同時期女貞子中黃酮含量存在變化，以青色女貞子總黃酮含量最高。

表1 女貞不同部位總黃酮含量（mg/g）

2.3 女貞不同部位總黃酮抗氧化能力的測定

2.3.1 總還原力的測定

女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）所含總黃酮的總還原力測定結果如圖2 所示，在相同濃度下，抗壞血酸（VC）溶液的總還原力明顯比女貞總黃酮溶液的總還原力強，女貞4 種樣品總黃酮總還原力隨樣品溶液濃度增加而加強，也具有良好的還原能力。各樣品還原能力差異顯著性分析結果如圖3 所示，樣品濃度在0.1～0.3 mg/mL 時，女貞葉與女貞莖還原能力大于女貞青果和紫果，差異顯著（P＜0.05）；在0.4 mg/mL 時，女貞青果的還原力增加至與女貞莖還原力相當，女貞葉還原能力較女貞其他3 個部位強（P＜0.05），女貞紫果還原能力小于女貞其他3 個部位（P＜0.05）；在0.5 mg/mL 時，女貞葉（1.747）、女貞莖（1.719）、青果（1.720）還原能力基本持平，紫果（1.535）還原能力較上述3 種小，且差異顯著（P＜0.05）。女貞葉和女貞莖與女貞子相比還原能力較好，不同時期的女貞子的還原力有一定的差異。

圖2 女貞各樣品黃酮總還原力

圖3 女貞各樣品黃酮總還原力比較

2.3.2 對DPPH·消除率的測定

女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）所含的總黃酮對DPPH·的清除效果如圖4 所示，抗壞血酸溶液對DPPH·的消除力高于女貞各樣品總黃酮，在0.01～0.06 mg/mL，隨著女貞各樣品濃度的增加，各樣品對DPPH·的消除率增加。在樣品濃度為0.06 mg/mL之后，女貞葉、女貞子（青果）、女貞子（紫果）對DPPH·的消除率增長緩慢趨于平穩；在樣品濃度為0.01 mg/mL時，三者對DPPH·消除效率達到95%以上；而女貞莖對DPPH·的消除率呈現下降趨勢。用SPSS 計算樣品對 DPPH·的半數清除率（IC50）并進行差異顯著性分析，結果如圖5 所示，VC、女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）為0.741、10.539、11.940、8.882、10.150 μg/mL，VC 對DPPH·的消除效率高于女貞各樣品，女貞子（青果）對DPPH·的消除效率要優于其他3種樣品，女貞4種樣品對DPPH·的消除力為：女貞子（青果）＞女貞子（紫果）＞女貞葉＞女貞莖。

圖4 女貞各樣品黃酮對DPPH·的清除率

圖5 女貞各樣品黃酮對DPPH·的IC50

2.3.3 對ABTS+·消除率的測定

女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）總黃酮對ABTS+·的消除效果測定結果如圖6 所示，VC對ABTS+·的消除力明顯高于各部位女貞總黃酮，隨著女貞各樣品濃度的增加，各樣品對ABTS+·的消除率增加，樣品濃度在0.20 mg/mL 時，女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）對ABTS+·消除效率分別為92.48%、90.33%、87.25%、81.51%。用SPSS 計算各樣品對DPPH·的IC50并進行顯著性差異分析，結果如圖7所示，VC、女貞葉、女貞莖、女貞子（青果）、女貞子（紫果）對ABTS+·的IC50為26.468、46.571、53.274、76.139、94.669 μg/mL，女貞葉對ABTS+·的消除力較女貞其他3 種成分效果好。女貞4 種樣品對ABTS+·的消除力為：女貞葉＞女貞莖＞女貞子（青果）＞女貞子（紫果）。

圖6 女貞各樣品黃酮對ABTS+·消除率

圖7 女貞各樣品黃酮對ABTS+·的IC50

3 討論

從植物中提取黃酮類化合物可以用來制備動物飼料添加劑，利用藥用植物的有效成分替代抗生素也是飼料業的研究熱點[25]。黃酮類化合物是藥用植物體內的次生代謝產物，可以在植物的根、莖、葉、花、果實和種子等各個器官中合成并積累，藥用植物的主要藥用成分含量隨著生長季節和生長年限發生著動態變化；同時，在不同器官與組織中合成或積累的成分質和量也有所不同[26-27]。

在料液比1∶50（g∶mL）、60%的乙醇溶液、超聲功率200 W、超聲90 min（重復1 次）的條件下提取女貞各部位總黃酮，女貞葉中含量達到35.21 mg/g，女貞莖中達16.38 mg/g，女貞子（青果）中達70.61 mg/g，女貞子（紫果）中達59.92 mg/g。試驗結果表明，黃酮類化合物在女貞樹不同組織器官中合成和積累的含量有所差異，推測女貞樹的果實和葉子是產生黃酮類化合物的主要組織器官；莖作為營養成分運輸的組織，黃酮類化合物產生和積累較少。青果時期女貞子中總黃酮含量大于紫果時期女貞子的總黃酮含量，12月份女貞子處于成熟時期，其黃酮化合物含量有所下降。仇小月等[28]研究發現女貞子中總黃酮、總三萜和多糖含量隨著月份的遞增整體均呈下降趨勢，總黃酮和總三萜在9月初達到最大值。鄭志慧等[29]研究發現女貞葉和女貞子黃酮含量隨采摘時間不同變化幅度明顯。研究結果與上述研究相一致，表明女貞果中黃酮類化合物的產生與積累隨時間有一定的變化。

3種抗氧化試驗數據表明女貞總黃酮有良好的抗氧化能力，其中女貞葉和女貞莖的總還原能力和對ABTS+·的清除能力較女貞子好；女貞子對DPPH·的清除能力優于女貞葉和女貞莖，由此推測女貞不同部位積累的黃酮成分結構存在差異，因此所起到的抗氧化活性不相同。隨著各樣品濃度增加，女貞子和女貞葉對DPPH·清除率均達到95%以上，且總體而言女貞子（青果）的抗氧化能力高于女貞子（紫果）的能力。上官琨瑤等[30]通過比較月季花不同采收期總黃酮含量與其抗氧化活性，發現月季花總黃酮含量在4 月份最高，7 月份抗氧化活性最強。研究結果也顯示女貞子不同時期的總黃酮抗氧化能力有所變化，女貞子（青果）的抗氧化能力高于女貞子（紫果）能力，表明在植物相同部位積累的黃酮種類及結構隨生長時間不同也會發生變化。

4 結論

女貞子的總黃酮含量較其他部位高，且青果黃酮得率（70.61 mg/g）也較紫果（59.92 mg/g）高，青果的抗氧化能力也優于紫果，因此在青果期間采摘可以獲取更高質量的總黃酮。而女貞葉總黃酮得率雖然較女貞子少，但抗氧化能力良好，且黃酮得率可達到35.21 mg/g。女貞葉資源豐富，也可作為女貞總黃酮獲取的材料之一，在制備飼料添加劑方面有一定的研究價值。