單細胞測序技術解析IgA腎病免疫細胞改變的研究進展

甘言剛,楊瓊瓊

(中山大學孫逸仙紀念醫院腎內科,中山大學孫逸仙紀念醫院醫學研究中心,廣東 廣州 510120)

IgA腎病(IgA nephrology,IgAN)是全球范圍內最常見的原發性腎小球腎炎之一,主要表現為半乳糖缺陷型 IgA1(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)在腎臟系膜區沉積[1]。幾乎所有患者在預期壽命內都可能出現終末期腎衰竭[2]。IgAN的發病機制尚不明確[3]。IgAN患者存在免疫系統紊亂[4],GWAS等遺傳學研究表明,IgAN患者存在抗原呈遞(如MHC)、補體系統(如CFH、CFHR3-1、ITGAM-ITGAX)和黏膜免疫(如DEFA、CARD9、VAV3)相關的單核苷酸多態性改變[5～8]。多種免疫細胞在IgAN發生發展中起重要作用。APRIL和BAFF可促進B細胞IgA類別轉換及糖基化異常導致IgAN[9,10]。B細胞中的TLR9可以識別PAMPs和/或DAMP,并通過APRIL和IL-6通路誘導Gd-IgA1的產生[11]。T細胞亞群的失衡亦可導致B細胞的增殖及Gd-IgA1分泌異常[4]。此外,在IgAN患者腎臟組織標本中發現免疫細胞浸潤,巨噬細胞及腎臟纖維化相關[12]。因此,探究免疫細胞在IgAN中的作用及機制具有重要科學研究價值。

傳統意義上的普通轉錄組測序(bulk RNA-seq)已經提供了大量的關于IgAN基因表達改變的信息。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)轉錄組學研究發現肉眼血尿發作期間的差異基因主要富集在IFN-γ信號傳導和抗原呈遞相關通路[13],CX3CR1基因及其配體fractalkine和IgAN患者肉眼血尿密切相關[14]。利用顯微切割技術將IgAN患者腎小球進行bulk RNA-seq,發現內皮增生與先天免疫應答、經典補體通路激活和基質轉換通路相關[15]。但是,bulk RNA-seq會掩蓋特異的細胞群體或狀態的基因表達情況,比如在Gd-IgA1產生以及在IgA1復合物沉積中起主要作用的細胞類型。單細胞RNA測序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)是在單個細胞水平對mRNA進行高通量測序的一項新技術,針對單個細胞研究其整體水平的基因表達情況,常用于識別新的細胞類型、確認罕見的細胞群、構建細胞狀態和系統發育的圖譜[16]。能夠克服傳統bulk RNA-seq限制,進行更加精細的細胞、分子水平的剖析。由于測序技術和細胞分離技術的快速發展,測序細胞數量由最初的幾百個細胞發展到成千上萬個細胞,并且測序性價比越來越高。分析方法也在持續改進,包括細胞類型的確定、高維數據的降維、無監督聚類、系統發生建模、軌跡推斷、多數據集的協同分析等。

在IgAN研究領域,通過將具有不同分子分型的免疫細胞進行聚類,以鑒定出可能與Gd-IgA1產生及沉積相關的免疫細胞亞群及表達差異。單細胞測序技術的發展還使腎臟中的細胞與細胞通訊研究、單細胞水平的調節狀態研究成為可能?？傊?單細胞測序技術的迅猛發展使人們能夠進一步了解免疫相關性腎病中細胞的異質性,并具有闡明致病性抗體產生及其在腎臟中沉積的復雜機制的巨大潛力,為確立免疫性腎病精準治療策略提供新的思路。本文綜述了在IgAN患者中進行的scRNA-seq研究的結果,隨著單細胞研究的深入,相信未來將有更多單細胞相關研究應用于IgAN發病及機制的探索。

1 scRNA-seq識別IgAN 患者外周血免疫細胞亞群及信號通路

IgAN患者腎臟系膜區存在以IgA1為主的聚合物沉積,主要為Gd-IgA1。研究顯示IgAN患者血清Gd-IgA1水平與患者eGFR下降相關[17]。Gd-IgA1主要由抗體分泌的B細胞或漿細胞產生,因此闡明Gd-IgA1產生細胞的起源以及轉錄組譜的改變具有重要的科學研究價值。我們課題組前期利用單細胞轉錄組測序技術發現IgAN患者B細胞降維聚類分為4個亞群,IgAN患者外周血B2亞群細胞數顯著增加,B2細胞數量與IgAN患者血清C4水平呈正相關。IgAN患者B細胞差異基因發現B細胞活化標記物CD69在IgAN B細胞中表達上調,差異基因富集于病毒感染相關的途徑中,包括皰疹病毒、人嗜T細胞病毒、EB病毒和巨細胞病毒,提示 B細胞在IgAN中的改變可能與病毒感染導致的B細胞激活有關[18]。此外,有研究利用scRNA-seq鑒定了細胞因子刺激IgAN患者來源的IgA1分泌細胞的特有亞群,該亞群具有 C1GALT1低表達的特征[19]。這些結果表明,細胞因子介導的特定亞群及信號轉導的改變對GdIgA1產生起重要作用。

輔助性T細胞極化失衡在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中起著重要作用[20,21]。幼稚CD4+T細胞在抗原-主要組織相容性復合體分子刺激下進行克隆擴增,分化為特異性效應輔助性T細胞,包括輔助性T細胞(helper T cell,Th) 1、Th2、Th17、濾泡輔助T細胞(follicular helper T cell,Tfh)和調節性T細胞[22]。Tfh細胞可通過IL-21和CD40L信號促進B細胞增殖和分化[23]。研究者在IgAN患者PBMC中發現Tfh、Th2及Th17比例增加,進一步利用scRNA-seq鑒定IgAN患者PBMC中CD4+T細胞亞群及信號通路改變[24]。該研究發現在IgAN患者中Tfh細胞差異基因在調節B細胞分化、CD40-CD40L信號通路、細胞粘附和細胞因子分泌相關通路富集。Tfh功能基因(包括ICOS、STAT3、IL21R、IL6R、LTA和TNFSF14)表達上調,進一步提示Tfh細胞存在活化表型,Tfh細胞可能通過激活了B細胞促進IgAN腎病發生發展[24]?；谶@些研究提示IgAN患者在特定抗原如病毒感染后可與T細胞相互作用共同促進B細胞激活分化,促進Gd-IgA1產生增多及疾病進展。Nefecon可靶向抑制Peyer’淋巴結的B細胞局部激活,減少IgAN患者蛋白尿及腎小球濾過率下降[25]。通過抑制B細胞BAFF和APRIL通路的激活(如泰它西普、阿塞西普)也可顯著降低IgAN患者血清IgA1水平及蛋白尿[26,27]。因此,scRNA-seq對于鑒定IgAN患者外周血免疫細胞亞群及通路具有重要價值,對于IgAN患者靶向B細胞治療有重要啟示作用。

2 scRNA-seq探究IgAN腎組織亞群及信號通路

在IgAN中各種因素可導致Gd-IgA1的合成增加,且易于形成多聚IgA1并與自身抗體形成免疫復合物。IgA1免疫復合物的沉積觸發系膜增殖和各種細胞因子、趨化因子和細胞外基質成分的分泌[28]。這些致病因素促進系膜細胞其他腎細胞之間相互作用,最終導致腎小球硬化、腎小管萎縮和間質纖維化[29]。一項納入13例IgAN患者、6例對照的研究對腎組織及外周血CD14+細胞進行了scRNA-seq,首次描繪了IgAN的腎臟組織單細胞水平圖譜,并初步探討了IgAN系膜增殖、免疫炎癥相關的可能發病機制[30]。研究中通過降維聚類共分為10個細胞群,主要有腎小管細胞、足細胞、內皮細胞、系膜細胞、腎小管閏細胞,還有部分免疫細胞如T細胞、巨噬細胞[30]。通過轉錄差異分析發現IgAN系膜細胞差異基因主要富集在細胞粘附、細胞外基質相關通路,且發現J CHAIN在系膜細胞高表達[30]。J CHAIN主要功能是機體在形成IgM或IgA多聚體時起到一個鉸鏈作用,以及輔助抗體的轉運、識別等[31]。該研究中首次發現J CHAIN在IgAN系膜細胞中的高表達,說明其可能是IgA抗體免疫復合物傾向于沉積在IgAN患者的腎小球系膜區的原因。通過對IgAN和對照組的外周血CD14+細胞進行單細胞測序分析發現,IgAN腎臟原位巨噬細胞表現出NOTCH信號通路、糖酵解、脂肪酸代謝等生物學過程的異常,還發現IgAN腎臟CD8+T細胞的免疫耗竭相關的基因表達增強,細胞毒性相關基因表達減弱,可能提示IgAN患者腎臟中的T細胞功能異常[30]。其他scRNA-seq發現IgAN患者系膜細胞表達JAGGED1,內皮細胞表達其受體NOTCH4,表明Jagged/Notch信號通路參與了IgAN的發病機制;PDGFRB在系膜細胞及成纖維細胞均表達,其可能是系膜增殖和腎纖維化的潛在治療靶點[32]。

3 scRNA-seq揭示IgAN早期改變

IgAN早期病變發生的機制尚不明確,scRNA-seq技術可以發現早期轉錄組改變及細胞間相互作用。ddY小鼠是一種自發性IgA腎病動物模型,在系膜區可見 IgA以及 IgG、IgM 和 C3 的共沉積[33]。研究者利用ddY IgAN小鼠模型,基于scRNA-seq技術探討IgA腎病早期階段發生的分子變化。發現內皮細胞是單細胞水平基因表達差異最顯著的細胞類型,其在疾病早期免疫細胞招募和浸潤中發揮重要作用。內皮細胞中表達水平顯著上調的基因與內皮細胞功能紊亂、促炎以及介導T細胞激活遷移等過程密切相關,提示內皮細胞對免疫細胞及白細胞的激活和招募發揮重要的作用[34]。該研究揭示了內皮細胞在IgAN早期階段特別是免疫細胞招募和浸潤中的重要作用。抑制內皮細胞相關差異基因及信號通路可能是IgAN早期階段干預的重要手段。

4 IgAN細胞間相互作用分析

細胞之間具有十分復雜的相互作用,這些相互作用在疾病發生及發展中起著至關重要的作用。細胞-細胞之間的相互作用可以從scRNA-seq數據中計算受體-配體表達值相關性進行研究。在IgAN患者中免疫細胞之間及免疫細胞與腎臟細胞中存在廣泛的相互作用。NK細胞和經典單核細胞是IgAN中主要相互作用的細胞,NK細胞的傳出和傳入相互作用強度均降低,而單核細胞的相互作用強度均升高;在對照組中發現6個信號通路(TNF、IL16、CXCL、MPZ、FASLG和NCAM)是特有的,而有2個信號通路(MIF、LIGHT)在IgAN中特有[18]。IgAN患者Tfh細胞與B細胞相互作用增強,IgAN患者的多種受體-配體特別是LTA/TNFSF14(LIGHT)-TNFRSF14的相互作用增強[24]。在腎臟中,系膜細胞和內皮細胞通訊作用最強,說明在IgAN患者系膜細胞增殖過程中,內皮細胞與系膜細胞之間可能存在緊密的相互作用,共同導致了系膜區的病理變化[30]。此外,系膜細胞與巨噬細胞、T細胞亦存在較強的相互作用,既往研究亦發現巨噬細胞浸潤與IgAN患者不良預后相關[35]。此外,在IgAN腎組織中系膜細胞與足細胞亦存在顯著的相互作用,這可能也是IgAN患者出現蛋白尿的原因[32]。綜上,IgAN存在細胞間通訊改變,因此改變IgAN患者異常細胞間通訊可能是抑制B細胞激活及減少蛋白尿的潛在治療策略。

5 思考與挑戰

近年來,單細胞水平的分析使得我們開始理解細胞群體的復雜性和異質性,克服了傳統bulk RNA-seq測序分析不足以完全表征生物學復雜性的缺點。ScRNA-seq促進了IgAN的機制研究,促進了IgAN患者診斷和治療的發展。然而,在單細胞研究廣泛開展的大背景下,我們也不得不去思考單細胞技術應用于IgAN研究的局限性。首先,在單細胞的分離和捕獲過程中,單細胞的活性和完整性可能受到影響,從而導致下游分析中顯示的細胞功能可能已經不同于其在體內環境下的功能狀態;第二,真核細胞轉錄并不以穩定的基礎速率進行,而是以脈沖形式出現。因此,在一個特定的時間點檢測到細胞中特定基因的轉錄本是一個不明確的結果,對結果的解釋應側重于通路分析和基因集合富集分析,而不是單個基因的表達或功能作用。第三,除了scRNA-seq的這些固有局限性之外,scRNA-seq依賴于存活的單細胞懸液,這種懸液很容易從外周血或淋巴結中獲得,但通常很難從實體組織中獲得。樣本保存條件的差異也可以引起轉錄組的大量變化。第四,在不同的時間處理樣品,即使有輕微的技術變化,也會產生嚴重的批處理效應。

綜上,IgAN是最常見的腎小球疾病,其異質性強,治療存在挑戰,發病機制尚未闡明。scRNA-seq從單細胞層面解析了IgAN患者PBMC及腎組織細胞亞群及通路改變。IgAN患者外周血B細胞差異基因與B細胞激活、病毒感染相關通路相關,且與Tfh細胞相互作用增強。IgAN腎組織中的系膜細胞、內皮細胞及其與免疫細胞之間存在廣泛細胞間相互作用。未來隨著蛋白組學、表觀組學及空間轉錄組技術發展,將成為揭示IgAN發病機制的更為有力技術和方法。