不同品種哈密瓜果實脯氨酸代謝對低溫的響應

畢 瑩，王新宇，李 慧，黃 帥，張 琪，雷雅馨，王 雪，王富鑫，許文昌，王 靜

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

哈密瓜（Cucumis melovar.saccharinus）屬葫蘆科、甜瓜屬、厚皮甜瓜類，是新疆傳統的名優特產，其肉質松脆、味道香甜、營養豐富，深受國內外消費者的喜愛[1]。但哈密瓜果實生理代謝旺盛，產季集中且采收溫度較高，采后衰老和品質劣變迅速，易造成大量經濟損失[2]。低溫冷藏是哈密瓜果實保鮮最有效的方法之一，適當的低溫可有效抑制其果實采后呼吸作用和乙烯的生成，延緩果實衰老，減少果實采后腐爛損失。但哈密瓜果實對低溫環境敏感，不適宜的低溫易引起冷害。冷害的發生嚴重降低了哈密瓜果實采后品質，影響其商品附加值，限制了低溫冷藏及冷鏈物流技術在哈密瓜采后保鮮領域的應用與推廣[3]。因此，探究哈密瓜果實發生冷害癥狀的機理，有助于緩解哈密瓜產業的浪費問題以及振興新疆地區果蔬產業的經濟。

國外研究顯示，脯氨酸作為細胞內的滲透調節物質，在提高果蔬的抗冷性方面發揮非常重要的作用。當果蔬受到低溫脅迫時，脯氨酸會開始大量積累，它可以增加細胞滲透壓，穩定細胞膜和亞細胞結構，保護細胞免受應激下的氧化損傷，從而維持細胞膜的完整性，提高植物的抗冷性[4-5]。李小安[6]在研究低溫脅迫對不同扁蓿豆種子內游離脯氨酸的影響時發現，低溫脅迫可以通過提高植物體內游離脯氨酸含量從而適應低溫逆境、減輕低溫傷害，增強其抗冷能力。陳代慧等[7]探究低溫脅迫對不同品種山茶花的影響，結果發現在低溫環境中存放越久，體內脯氨酸含量越高。陳智智[8]在對桃果實進行外源脯氨酸處理后，發現脯氨酸能通過提高Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrrolidine-5-carboxylic acid synthase，P5CS）、鳥氨酸轉氨酶（ornithine transaminase，OAT）和谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）的活性，降低脯氨酸脫氫酶（proline dehydrogenase，ProDH）的活性，明顯降低桃果實的冷害指數，延緩冷害癥狀的發生。李大紅等[9]在研究如何提高羽衣甘藍的抗寒性時，發現P5CS基因能顯著提高轉基因羽衣甘藍脯氨酸的合成速度，此外P5CS還參與了其他的代謝調控，能夠增加滲透調節物質、減輕細胞質膜的氧化，從而在整體上提高了羽衣甘藍的抗寒性，該實驗結果說明P5CS是植物通過脯氨酸代謝提高耐冷性途徑中的關鍵酶。果蔬冷害的發生影響了脯氨酸的含量，而脯氨酸作為氨基酸的一種，氨基酸總量也與冷害有密切的聯系。馮雙慶等[10-11]在研究冷害溫度下番茄和黃瓜的氨基酸含量變化時發現，冷害的發生會降低番茄和黃瓜體內總氨基酸含量。劉平香[12]對大蒜貯藏過程中的特征成分進行分析，結果發現代謝組學實驗可以對代謝物進行定性和相對定量分析。

已有研究表明，從普通菜豆中分離克隆得到了P5CS酶的基因PvP5CS1和PvP5CS2[13]。在滲透調節的逆境脅迫前期階段均會出現PvP5CS1和PvP5CS2mRNA的積累，而脯氨酸積累則是出現在中后期階段，PvP5CS1和PvP5CS2mRNA的積累明顯比脯氨酸積累要早。在滲透和脅迫環境條件影響下，PvP5CS1和PvP5CS2基因與AtP5CS1[14]和OsP5CS1[15]基因類型一樣，在促進脯氨酸的合成轉化中可起到十分重要的調控作用。由此說明，測定P5CS基因類型對研究脯氨酸代謝有十分重要的意義。因此，研究脯氨酸及其代謝過程中的關鍵酶P5CS在逆境脅迫下的調控機理和抗性機制有利于果蔬抵御不同程度的侵害。但是對哈密瓜果實采后此方面的研究目前鮮見相關報道，而研究主要集中在細胞膜脂[16]、活性氧[17]、滲透調節物質[2]等方面，其中對哈密瓜果實低溫脅迫下脯氨酸代謝的表達分析主要集中在某一品種上，缺少耐冷性強和弱的品種之間的研究。

本研究重點分析在低溫貯藏環境中耐冷性較弱的早熟‘西周密25號’和耐冷性較強的晚熟‘伽師瓜’果實脯氨酸代謝、氨基酸總量以及冷害發生的差異，并通過全基因合成哈密瓜果皮CmP5CS基因類型，探究抗冷性不同的哈密瓜果實在低溫脅迫中的應答機理，旨在為哈密瓜果實采后的貯運保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘西周密25號’哈密瓜（可溶性固形物質量分數為13.44%），于2022年7月15日采收于新疆維吾爾自治區五家渠市商品瓜基地；‘伽師瓜’哈密瓜（可溶性固形物質量分數為9.17%），于2022年8月9日采收于新疆維吾爾自治區喀什地區伽師縣商品瓜基地。同一個品種選擇成熟度基本相同、大小均一、無病蟲害、無腐爛和無機械損傷的瓜進行采摘，采摘時留取2～5 cm果柄，將采后哈密瓜果實單獨套裝發泡網，每4 個裝于1 個標準紙箱，立即運送至新疆農業大學食品科學與藥學學院504實驗室進行清洗，隨即運至（3.0±0.5）℃冷庫內貯藏（根據劉同業[18]、安瑞麗[19]等的研究結果，‘西周密25號’和‘伽師瓜’哈密瓜果實均能在3 ℃下發生冷害癥狀）。

磺基水楊酸、茚三酮、甲苯 天津市大茂化學試劑廠；冰乙酸 天津市鑫鉑特化工有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 天津市科密歐化學試劑有限公司；丙三醇 國藥集團化學試劑有限公司；聚乙烯吡咯烷酮 安徽Biosharp公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、氫氧化鈉 天津市福晨化學試劑廠；酮戊二酸 上海展云化工有限公司；L-鳥氨酸 美國Sigma公司；還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、NAD＋美國BioFRoxx公司；二硫蘇糖醇 北京Solarbio公司；Tris、氯化鉀、氯化鎂 廣東方信生物科技有限公司；谷氨酸鈉天津市凱通化學試劑有限公司；鹽酸 珠海市華成達化工有限公司；無水碳酸鈉、碳酸氫鈉 天津市永大化學試劑有限公司；以上所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

QL-861渦旋振蕩器 江蘇省海門市麒麟鱗醫用儀器廠；PTT-A＋200電子天平 福州華志科學儀器有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器有限公司；SF-GL-16A高速冷凍離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；P4PC型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；XW-80A高速分散器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DW-40L92醫用低溫保存箱青島海爾特種電器有限公司；SW-CJ-2D潔凈工作臺蘇州凈化設備有限公司；Mini Pro 300V Power Supply電泳儀 美國Major Science公司；EDC-810普通聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀北京東勝創新生物科技有限公司；MA-6000實時PCR（real-time PCR）儀 蘇州雅睿生物技術有限公司；2500凝膠成像系統 上海天能公司；AB Sciex QTRAP 6500＋質譜儀 美國Waters公司；AB Sciex ExionLCTMAD液相色譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 冷害指數的測定

貯藏過程中，自放貯藏冷庫14 d后，各品種哈密瓜分別每7 d取3 個果實3 個重復，共計9 個瓜移至室溫放置5 d后，記錄果實變化，共取6 次。冷害指數計算根據Bi Yang等[20]的方法，癥狀按嚴重程度分為5級（0級：果面光潔，沒有冷害癥狀；1級：有輕微的下陷冷害斑，占果面總面積10%以下；2級：冷害面積占果面的比例在11%～25%；3級：冷害面積占果面的比例在25%～50%；4級：冷害面積占果面總面積的50%以上），分別記錄兩組的冷害級數，冷害指數計算公式如下：

1.3.2 游離脯氨酸含量測定

參照曹建康[21]、Gao Hui[22]等的方法，并略作修改，稱取2 g哈密瓜果皮，加入5 mL經4 ℃預冷后的30 g/L磺基水楊酸溶液進行研磨提取，轉入試管中煮沸提取10 min，期間搖勻3～4 次，取出冷卻至室溫后，于4 ℃、12 000×g條件下離心20 min，收集上清液即為游離脯氨酸提取液。吸取上清液2 mL、酸性茚三酮溶液3 mL和冰乙酸溶液2 mL搖勻煮沸30 min，待冷卻后加入甲苯溶液4 mL，吸取上層溶液測定520 nm波長處吸光度，重復3 次。計算哈密瓜樣品中游離脯氨酸含量，單位為μg/g。

1.3.3 脯氨酸合成關鍵酶P5CS活性測定

參照黃琦輝[23]、Shang Haitao等[24]的方法，并略作修改，取2 g哈密瓜果皮，加入6 mL經4 ℃預冷的Tris-HCl緩沖液研磨，于4 ℃、12 000×g條件下離心25 min，取0.2 mL上清液加入2.4 mL Tris-HCl緩沖液、0.1 mL 25 mmol/L的MgCl2溶液、0.1 mL 75 mmol/L的谷氨酸鈉溶液、0.1 mL 5 mmol/L的ATP溶液，混勻后加入0.1 mL 0.4 mmol/L的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）溶液，測定反應液每30 s在340 nm波長處的吸光度變化，重復3 次。以每分鐘每克哈密瓜果實吸光度變化0.001為1 個P5CS活性單位，結果用U/g表示。

1.3.4 脯氨酸合成關鍵酶OAT活性測定

參照黃琦輝[23]、Esteban等[25]的方法，并略作修改，取2 g哈密瓜果皮，加入6 mL經4 ℃預冷的磷酸鉀緩沖液研磨，4 ℃、12 000×g離心25 min，取0.2 mL上清液加入2.2 mL 200 mmol/L的Tris-HCl緩沖液、0.2 mL 46.8 mmol/L的鳥氨酸溶液、0.2 mL 12.5 mmol/L的α-酮戊二酸溶液，混勻后加入0.4 mL 0.25 mmol/L的NADH溶液，測定反應液每30 s在340 nm波長處的吸光度變化，重復3 次。以每分鐘每克哈密瓜果實吸光度變化0.001為1 個OAT活性單位，結果用U/g表示。

1.3.5 脯氨酸降解關鍵酶ProDH活性測定

參照黃琦輝[23]、López-Carrión等[26]的方法，并略作修改，取2 g哈密瓜果皮，加入6 mL經4 ℃預冷的Tris-HCl緩沖液研磨，于4 ℃、12 000×g條件下離心25 min，取0.2 mL上清液加入2.4 mL 0.15 mmol/L的碳酸鈉緩沖液、0.2 mL 2.67 mmol/L的脯氨酸溶液，混勻后加入0.2 mL 10 mmol/L的NAD＋溶液，測定反應液每30 s在340 nm波長處的吸光度變化，重復3 次。以每分鐘每克哈密瓜果實吸光度變化0.001為1 個ProDH活性單位，結果用U/g表示。

1.3.6 real-time PCR

采用real-time PCR測定P5CS、OAT、ProDH基因相對表達量，提取RNA，設計引物CmP5CS-F、CmP5CS-R、CmOAT-F、CmOAT-R、CmProDH-F、CmProDH-R、18S-F(NEI)、18S-R(NEI)，cDNA合成與real-time PCR引物分析，根據本實驗中冷害發生的關鍵時間點，取貯藏在（3.0±0.5）℃條件下14、28、42 d的兩種哈密瓜果實，采用2-ΔΔCt分析方法，在赤道周圍約取2 cm厚的哈密瓜皮組織用來提取總RNA，取1 μL總RNA反轉錄成cDNA，然后取1 μL cDNA進行real-time PCR。

1.3.7 液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）測定氨基酸含量

參考Sun Lulu等[27]的方法，液氮研磨樣本，稱取一定量的樣本加入質譜水中，渦旋混勻為稀釋樣本；取稀釋樣本50 μL，加入200 μL含混合內標的沉淀劑（乙腈-甲醇（1∶1，V/V）），渦旋混勻，冰上靜置30 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取全部上清液進行LC-MS分析，每個樣品重復3 次，根據組間差異使用hiplot網站制作主成分分析（principal component analysis，PCA）圖。

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A相：含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液、B相：含0.1%甲酸的乙腈；柱溫：50 ℃；進樣量：1 μL；流速：0.3 mL/min。

質譜條件：電噴霧電離源，正離子電離模式。離子源溫度550 ℃，離子源電壓5 500 V，氣簾氣壓35 psi，霧化氣壓50 psi，輔助氣壓60 psi。采用多反應監測進行掃描。

1.3.8 全基因合成

對本研究所得脯氨酸代謝結果進行分析，確定P5CS基因表達差異的顯著性，后續使用全基因合成法對該基因進行合成。

1.4 數據處理與分析

實驗數據由WPS 2021及Origin 2022軟件進行數據分析并制圖，利用SPSS 26.0軟件對數據進行統計及顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 兩個品種哈密瓜果實貯藏期間冷害癥狀和冷害指數的比較

由圖1可知，‘西周密25號’在冷藏14 d后出現了冷害的癥狀，而‘伽師瓜’冷藏21 d才開始出現冷害癥狀，兩個品種哈密瓜果實冷害指數差異極顯著（P＜0.01）?！髦苊?5號’隨著冷藏時間的延長，冷害指數不斷升高，在冷藏42 d時達到46.67%?！煿稀?1～35 d時均出現輕微冷害癥狀，冷害指數均為4.44%，42 d冷害癥狀嚴重，此時冷害指數達到6.67%?！髦苊?5號’的冷害指數極顯著高于‘伽師瓜’果實的冷害指數（P＜0.01），說明“西周密25號”較“伽師瓜”在低溫條件下更易出現冷害癥狀。

圖1 兩個品種哈密瓜果實貯藏期間的冷害指數對比Fig.1 Comparison of chilling injury indices of two varieties of Hami melon during storage

2.2 兩個品種哈密瓜果實低溫貯藏期間游離脯氨酸含量的變化

由圖2可知，在兩個品種哈密瓜果實低溫貯藏期間，游離脯氨酸含量均整體呈現上升趨勢，‘伽師瓜’在0～28 d游離脯氨酸含量始終處于上升趨勢，到35 d開始下降，42 d又開始升高，此時達到42.773 μg/g?！髦苊?5號’隨著貯藏時間的延長，游離脯氨酸含量持續升高，在42 d達到38.114 μg/g?！煿稀挠坞x脯氨酸含量在整個貯藏期里始終高于‘西周密25號’，其中在0 d和14 d顯著高于‘西周密25號’（P＜0.05），在7、21～42 d極顯著高于‘西周密25號’（P＜0.01）。說明在低溫脅迫條件下，耐冷性強的‘伽師瓜’果實更能激發游離脯氨酸含量的增加。

圖2 兩個品種哈密瓜果實低溫貯藏期間游離脯氨酸含量的變化Fig.2 Changes in free proline contents of two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.3 兩個品種哈密瓜果實低溫貯藏期間P5CS活性及基因表達量的變化

由圖3A可知，兩個品種哈密瓜果實在低溫貯藏期間，P5CS活性整體呈上升趨勢?！髦苊?5號’和‘伽師瓜’果實分別從貯藏初期的30.800 U/g和44.800 U/g上升至貯藏結束時的86.800 U/g和126.000 U/g，分別增長了1.818 倍和1.8125 倍。由此可見，‘西周密25號’和‘伽師瓜’P5CS活性在整個貯藏期內的增長速率大致相同。但是‘伽師瓜’在第0天和14天時P5CS活性顯著高于‘西周密25號’（P＜0.05），在第28～42天的P5CS活性極顯著高于‘西周密25號’（P＜0.01），說明‘伽師瓜’在受到低溫脅迫時，體內的P5CS響應較敏感，激發果實積累游離脯氨酸，提高其耐冷性。而‘伽師瓜’在第14～21天時，該酶的活性降低，推測可能是因為‘西周密25號’發生冷害所致。CmP5CS相對表達量如圖3B所示，在第28天時，‘伽師瓜’中CmP5CS相對表達量高于‘西周密25號’，這與兩個品種哈密瓜果實酶活性變化相似，其他兩個時間點與酶活性差異相反。而各品種CmP5CS相對表達量的變化趨勢與其對應的酶活性變化趨勢相近，‘西周密25號’都呈現先下降后升高的趨勢，‘伽師瓜’都呈現貯藏期內大致升高的趨勢，推測CmP5CS相對表達量可能與P5CS活性以及哈密瓜果實發生冷害癥狀有關。

圖3 兩個品種哈密瓜果實低溫貯藏期間P5CS活性（A）及其CmP5CS基因相對表達量（B）的變化Fig.3 Changes in P5CS activity (A) and its relative expression (B) in two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.4 兩個品種哈密瓜果實低溫貯藏期間OAT活性及基因表達量的變化

由圖4A可知，兩個品種哈密瓜果實在低溫貯藏期間，OAT活性整體呈上升趨勢，貯藏結束時‘西周密25號’和‘伽師瓜’果實OAT活性分別達到48.000 U/g和64.000 U/g，較貯藏初期分別增長了0.636 倍和1.010 倍，‘伽師瓜’果實的OAT保護效應較顯著?！煿稀疧AT活性在第7天和第21～42天期間顯著高于‘西周密25號’（P＜0.05），在第14天極顯著高于‘西周密25號’（P＜0.01）。CmOAT相對表達量如圖4B所示，在第28天時，‘伽師瓜’的CmOAT相對表達量高于‘西周密25號’，與兩個品種哈密瓜果實酶活性相似，其他兩個時間點與酶活性相反，并且‘伽師瓜’CmOAT相對表達量整體增長幅度較小，“西周密25號”增長幅度較大，與OAT活性增長趨勢較為相近。

圖4 兩個品種哈密瓜果實低溫貯藏期間OAT活性（A）及其CmOAT基因相對表達量（B）的變化Fig.4 Changes in OAT activity (A) and its relative expression (B) in two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.5 兩個品種哈密瓜果實低溫貯藏期間ProDH活性及基因表達量的變化

由圖5A可知，兩個品種哈密瓜果實在低溫貯藏期間，ProDH活性整體呈下降趨勢?！髦苊?5號’及‘伽師瓜’ProDH活性分別由原始點的80.000 U/g和56.000 U/g下降至29.333 U/g和26.667 U/g，下降幅度分別為63.3%和52.4%，‘西周密25號’下降幅度更大?！髦苊?5號’在第0天和第35天ProDH活性顯著高于‘伽師瓜’（P＜0.05），可能與其冷害發生程度有關，且‘西周密25號’較‘伽師瓜’的ProDH活性高。說明‘西周密25號’較‘伽師瓜’果實更能促進果實的游離脯氨酸含量下降，從而導致冷害加劇，該結果與圖3和圖4相印證。CmProDH基因相對表達量如圖5B所示，‘西周密25號’CmProDH相對表達量在第14天和第42天均高于‘伽師瓜’，且兩個品種哈密瓜果實CmProDH相對表達量在整個貯藏期呈下降趨勢，與其ProDH活性變化趨勢大致相同。

圖5 兩個品種哈密瓜果實低溫貯藏期間ProDH活性（A）及其CmProDH基因相對表達量（B）的變化Fig.5 Changes in ProDH activity (A) and its relative expression (B) in two varieties of Hami melon fruits during low-temperature storage

2.6 兩個品種哈密瓜果實低溫貯藏期間各氨基酸總含量變化

根據圖6顯示，各個樣品的每組平行數據點在PCA圖中較為靠近，證明各平行樣品在主成分空間中具有相似的特征。

圖6 兩個品種哈密瓜果實0、14、28、42 d樣品氨基酸PCA圖Fig.6 PCA plot for variations in total amino acid contents in two varieties of Hami melon fruits during storage

結合圖7和表1可以看出，‘西周密25號’和‘伽師瓜’果實在取樣時間內，不同氨基酸含量的變化趨勢及含量不同。在冷害脅迫發生過程中與脯氨酸合成密切相關的谷氨酸途徑占優勢，兩個品種哈密瓜果實的谷氨酸含量整體呈下降趨勢，且‘西周密25號’谷氨酸含量下降較快，到第42天下降幅度為89.1%，‘伽師瓜’谷氨酸含量下降幅度較小，為71.7%，說明‘伽師瓜’果實的脯氨酸含量保留較多，較‘西周密25號’果實耐冷性更強，表1中的脯氨酸含量變化也證明了該結論。

表1 兩個品種哈密瓜果實不同貯藏時間下各氨基酸總含量Table 1 Total amino acid contents in two varieties of Hami melon fruits at different storage times mg/g

圖7 兩個品種哈密瓜果實23 種氨基酸提取離子流色譜圖Fig.7 Extracted ion chromatogram of 23 amino acids detected in two varieties of Hami melon fruits

2.7 哈密瓜P5CS基因合成序列分析

為探究脯氨酸代謝中關鍵酶P5CS的同源性，根據以上實驗結果，挑選耐冷性較差的‘西周密25號’哈密瓜進行全基因合成，測序結果經NCBI網站BLAST比對，如圖8所示，通過同源進化樹分析發現該片段與甜瓜（LOC103485529）的P5CSmRNA在同一分支，且同源性為100%；與黃瓜、冬瓜、西葫蘆、番南瓜P5CSmRNA同源性在90%以上；與葡萄、梨、橡膠P5CSmRNA同源性在50%以上。說明哈密瓜果皮中P5CS基因與甜瓜中P5CS基因功能相同，響應冷害的機理相似。測序結果顯示，P5CS基因編碼蛋白質分子量為77.7，等電點為6.28。該結果可為后續篩選驗證能調控脯氨酸代謝的關鍵上游轉錄因子的研究奠定基礎。

3 討論

不同品種的哈密瓜果實可能會因為采摘期、受日照時間長短、栽種土壤等不同而具有不同的冷害發生溫度、時間以及冷害癥狀。冷害指數是判斷哈密瓜冷害程度最直觀的品質指標，在本實驗中，‘西周密25號’從14 d開始出現淺褐色的凹陷塊狀斑，并隨著時間的延長，冷害斑的面積越來越大，顏色越來越深，瓜體開始變軟凹陷產生水浸狀[28]，汁水通過變軟損壞的外皮流出?！煿稀睦浜Τ潭认噍^于‘西周密25號’要輕許多，在21 d時出現瓜體變軟凹陷并流汁的冷害現象，在42 d后開始出現了深褐色的凹陷塊狀斑，以上現象說明，在哈密瓜果實出現冷害現象時，細胞膜會受到損害，反映在果皮上，在3 ℃貯藏條件下，‘伽師瓜’受到損害的程度小于‘西周密25號’，說明‘伽師瓜’的耐冷性要好于‘西周密25號’。

游離脯氨酸是果蔬體內一種非常重要的逆境脅迫響應物質，通常情況下游離脯氨酸的積累與代謝主要與OAT、P5CS和ProDH等酶有關，其中OAT和P5CS均是在脯氨酸代謝轉化過程中形成的一種合成酶，ProDH是脯氨酸脫氫酶，在3 種酶的共同作用下，動態調節和控制的循環構成了果蔬體內游離脯氨酸的合成積累與自然降解的往復過程[29]。在本實驗中發現，‘西周密25號’與‘伽師瓜’在整個低溫貯藏期游離脯氨酸含量都明顯升高，且增長速率較快，說明在低溫脅迫下哈密瓜果實可以通過快速大量積累體內游離脯氨酸抵御外界破壞，減輕對果皮細胞造成的侵害。與青茄[30]、黃瓜[31]、青椒[32]、‘新密3號’哈密瓜[33]等果實在低溫環境中通過提高自身的游離脯氨酸含量抵御低溫脅迫的現象相似?！煿稀挠坞x脯氨酸含量始終顯著高于‘西周密25號’，說明在3 ℃條件下‘伽師瓜’的耐冷性好于‘西周密25號’，與冷害指數的結果吻合。在整個低溫貯藏過程中兩個品種哈密瓜果實P5CS活性均升高，說明哈密瓜果實可以通過提高P5CS活性抵御低溫脅迫，其中‘伽師瓜’的P5CS活性整體高于‘西周密25號’，這與游離脯氨酸含量的結果相對應，同時兩個品種哈密瓜果實基因相對表達量也隨著貯藏時間的延長而升高，與酶活性變化情況相同，證實哈密瓜果實會通過提高P5CS活性維持游離脯氨酸含量的增加，從而提高哈密瓜的抗寒性，與玉米[34]、桃[35]、枇杷[36]等果實的研究結果相似。OAT是游離脯氨酸合成過程中的關鍵酶，在兩個品種哈密瓜果實中的變化與游離脯氨酸含量相同，在整個貯藏期內呈上升趨勢，且‘伽師瓜’的OAT活性始終高于‘西周密25號’，相應基因的相對表達量也在貯藏初期至貯藏末期內升高。ProDH作為脯氨酸降解第一步中的限速酶，可以為植物提供能量[37]。在本實驗中，隨著低溫貯藏時間的延長，兩個品種哈密瓜果實ProDH活性逐漸降低，基因相對表達量在貯藏后期低于貯藏前期，說明哈密瓜果實ProDH基因的相對表達量與酶活性較為一致，該結果與羅丹等[38]、王延圣[39]和劉彩紅[40]的部分研究相似。

本實驗發現‘西周密25號’在冷藏中大部分氨基酸總含量隨著貯藏時間的延長而降低，說明‘西周密25號’哈密瓜果實冷害癥狀嚴重，冷害的發生破壞了其細胞及蛋白質結構，消耗大量營養物質，降低其組織內的氨基酸含量，與龔曉平[41]、黃愛萍[42]等研究結果相似；而‘伽師瓜’的氨基酸總含量增加，與土壇樹果實[43]、‘紅地球’葡萄[44]的氨基酸變化趨勢相似。該變化是否與其成熟度低有關，具體成因目前尚不可知，有待進一步探究。對耐冷性較差的‘西周密25號’哈密瓜進行全基因合成，得出哈密瓜CmP5CS與甜瓜P5CS親緣關系很近，同源性達到100%，表明‘西周密25號’哈密瓜中P5CS基因在調控脯氨酸合成過程中與甜瓜中的P5CS基因功能相同。

4 結論

哈密瓜果實和甜瓜果實親緣關系極近，當哈密瓜果實遭受到低溫脅迫時，會通過降低ProDH活性、提高P5CS以及OAT活性提高游離脯氨酸含量，提升自身耐冷性。而冷害嚴重的哈密瓜果實體內能量消耗快、細胞及蛋白質結構會被破壞，從而降低果實各氨基酸的總含量。綜合分析游離脯氨酸、谷氨酸及脯氨酸總量變化，說明‘伽師瓜’的耐冷性強于‘西周密25號’。