共包埋姜黃素和還原型谷胱甘肽的納米脂質體的制備、修飾與表征

于少軒，逄格雨，張子豪，李世陽，徐 碩，肖海芳，朱蘭蘭，宋元達

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255000）

脂質體是由磷脂（磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿等）及其他組分如膽固醇和親水性聚合物共軛脂質形成的雙層封閉球形囊泡[1]。隨著技術的不斷發展，脂質體的制備工藝不斷完善，被廣泛研究和應用[2-3]。親脂性差異很大的藥物可以同時封裝在脂質體中，根據藥物的溶解性，既可以封裝在磷脂雙分子層中，也可以截留在水中，還可以封裝在雙層界面處[1,4]。近年來，兩種或多種藥物的聯合使用因具有減少每種藥物的個體攝入量和提高其協同效應的優點，引起人們的廣泛關注[5-6]。研究表明，當兩種藥物被同一個載體遞送到細胞或動物體內時，可以通過逐步暴露和吸收，提高其穩定性、生物利用率和治療效果[7-8]。例如，Zhang Chuanmin等[7]制備用于聯合遞送生存素siRNA和紫杉醇的陽離子脂質體，并通過其在肺癌中的協同作用，降低紫杉醇的劑量，增強抗腫瘤療效。Zhang Lu等[8]設計并合成一種具有順序釋放特性的納米脂質體（nanoliposomes，LIP），可同時遞送地塞米松和多烯紫杉醇，以調節腫瘤基質，并協同殺死腫瘤細胞；因為地塞米松與膽固醇結構相似，可能與膽固醇一樣被包裹在磷脂層中，而多烯紫杉醇由于其較強的疏水性被包裹在兩層磷脂層之間。

姜黃素（curcumin，CUR）被認為是姜黃制劑中最活躍的成分，具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂和預防老年癡呆等多種生理功能，還可作為天然著色劑、防腐劑等用于食品加工[9]。還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸組成的三肽，其分子結構中含有γ-谷氨?；汀猄H兩種活性基團，在生物體內廣泛存在且具有多種重要的生理功能，如抗氧化、解毒、消除疲勞、延緩衰老、預防糖尿病和癌癥以及參與體內三羧酸循環和糖代謝等[10-11]。盧均坤等[12]發現CUR和GSH聯合使用對阿霉素所致大鼠急性心肌損傷具有保護作用，能夠抑制心肌細胞變性及線粒體損傷。雖然CUR和GSH都具有優異的生物活性，在膳食補充中具有重要作用，但它們穩定性差，易受溫度、氧氣、光照、金屬離子、pH值等環境因素的影響，同時代謝速度快、生物利用率低，而且CUR的水溶性很差[13]。因此，CUR和GSH在食品、保健品和藥品中的應用受到很大限制。通過合理的遞送載體設計，將CUR和GSH同時包埋到一種納米顆粒中，并實現足夠的裝載能力，可能是同時提高二者穩定性和協同作用的可行思路。然而，脂質體作為載體材料存在包埋率較低、穩定性差、顆粒易融合或絮凝、藥物易泄漏等問題，通過與其他化合物結合可以提高脂質體的包埋率和穩定性[14-15]。最近，本團隊通過靜電層層自組裝技術在包埋GSH的脂質體表面依次修飾殼聚糖（chitosan，CH）和海藻酸鈉（sodium alginate，AL），制備出雙層多糖修飾的LIP[11,16]；與未修飾的脂質體相比，CH單層修飾和AL-CH雙層修飾都可以明顯增加GSH的包埋率，增強脂質體的熱穩定性，減緩其在模擬腸消化液中的崩解，起到緩釋GSH的作用。

本研究制備同時包埋CUR和GSH的納米脂質體（curcumin-glutathione nanoliposomes，CGLIP），將CH和AL逐層結合到LIP表面得到多糖修飾的CGLIP（ALCH-CGLIP），并通過各種光譜學手段和電子顯微鏡對LIP的包埋率、緩釋作用、粒徑、表面電位、微觀形貌、化學組成、熱穩定性等進行表征，考察LIP作為CUR和GSH協同傳遞載體的潛力，以期為同時添加CUR和GSH或其他生物活性物質的新型功能食品或藥品開發提供一定的理論參考和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆卵磷脂、谷胱甘肽 上海麥克林生化科技股份有限公司；膽固醇（分析純）北京索萊寶科技有限公司；吐溫-80、殼聚糖、膽鹽（分析純）、海藻酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；CUR標準品（純度＞98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；L530型水平離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Centrifuge 5810R型高速離心機 德國Eppendorf公司；RG-18型磁力攪拌器 河南金博儀器制造有限公司；KYC-100B恒溫培養搖床 上海新苗醫療器械制造有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計、IRAffinity-1S型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 日本島津公司；FreeZone?6 L冷凍干燥機 美國Labconco公司；JY99-IIDN超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer Nano ZS90納米粒度分析儀 英國馬爾文帕納科公司；H-9500透射電子顯微鏡 日本日立公司；DSC-Q2000型差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 不同LIP的制備

參考前期工作并適當修改后，通過薄膜水合法結合超聲技術制備不同負載的LIP[16-17]。準確稱取250 mg大豆卵磷脂和25 mg膽固醇于燒杯中，加入25 mL無水乙醇，40 ℃攪拌直至完全溶解。制備包埋CUR的LIP時，稱取4 mg CUR加入上述混合溶液中，在40 ℃、避光條件下繼續攪拌，直到CUR全部溶解。將混合溶液全部轉移至圓底燒瓶，用10 mL乙醇分次洗滌燒杯，將洗液倒入圓底燒瓶中，在40 ℃、-0.1 MPa條件下旋蒸。待乙醇完全除去，燒瓶內壁形成均勻的薄膜，加入20 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.05 mol/L、pH 6）或者含有4 mg/mL GSH的PBS，在40 ℃、常壓條件下旋轉水合30 min，使燒杯內壁的薄膜洗脫。將燒瓶中的洗脫液轉移至50 mL離心管中，并在冰浴中通過超聲波細胞破碎儀超聲10 min（250 W，工作3 s、間隔3 s）。將經超聲處理的溶液在4 ℃靜置2 h，然后以4 ℃、3 000 r/min離心10 min，上清液即為制得的LIP。分別制備空LIP（BLIP）、單包埋CUR的LIP（CLIP）、單包埋GSH的LIP（GLIP）和共包埋CUR和GSH的LIP（CGLIP），并將所有LIP樣品在4 ℃、避光條件下保存備用。

1.3.2 LIP的多糖修飾

對BLIP、CLIP、GLIP和CGLIP 4 種LIP分別進行CH修飾和CH-AL修飾。脂質體的CH修飾：稱取100 mg CH，加入100 mL質量分數為1%的冰醋酸溶液，攪拌至完全溶解后，用1 mol/L的氫氧化鈉溶液將CH溶液的pH值調至5.5，用0.45 μm水相過濾器過濾。分別取20 mL BLIP、CLIP、GLIP和CGLIP樣品溶液，在100 r/min的攪拌條件下將樣品溶液按體積比1∶1逐滴滴加到CH溶液中，靜置1 h，得到CH修飾的脂質體，分別記為CHBLIP、CH-CLIP、CH-GLIP和CH-CGLIP。脂質體的CH-AL修飾：稱取100 mg AL，加入100 mL蒸餾水，攪拌至完全溶解后，用5 mol/L的鹽酸溶液將AL溶液的pH值調至5.5，用0.45 μm水相過濾器過濾。分別取20 mL CHBLIP、CH-CLIP、CH-GLIP和CH-CGLIP溶液，在100 r/min的攪拌條件下按體積比1∶1逐滴滴加到AL溶液中，靜置1 h，得到CH-AL修飾的脂質體，分別記為AL-CHBLIP、AL-CH-CLIP、AL-CH-GLIP和AL-CH-CGLIP。將修飾后的LIP也置于4 ℃、避光條件下保存備用。

1.3.3 測定CUR和GSH的包埋率

1.3.3.1 繪制CUR和GSH標準曲線

以無水乙醇為溶劑，制備不同質量濃度的（1.25、2.5、5、10、20 μg/mL）CUR溶液，各取200 μL于96 孔板中測吸光度，并繪制CUR的標準曲線[16]。另外，根據GSH檢測試劑盒的方法繪制GSH的標準曲線。CUR和GSH的標準曲線方程分別為Y＝0.064 237 5＋0.005 127X（R2＝0.999）和Y＝0.096 41＋0.001 85X（R2＝0.999）。

1.3.3.2 測定CUR和GSH的包埋率

萃取步驟：收集制備LIP時在離心過程中產生的沉淀（1.3.1節），加水分散并定容為10 mL，取1 mL沉淀溶液加等體積氯仿，劇烈振蕩混合2 min后，將溶液靜置分層，分別收集上層水溶液（可能含有GSH）和下層氯仿溶液（可能含有CUR）。重復上述萃取步驟，直到氯仿溶液無色為止。將每次萃取的下層氯仿溶液合并，用氮吹儀將氯仿吹干，加入200 μL無水乙醇將離心管壁上的殘留物質充分溶解。

用酶標儀在424 nm波長處測定溶液的吸光度[18]。同時，合并每次萃取的上層溶液，取200 μL合并溶液，加入到96 孔板中，根據GSH檢測試劑盒說明書測定。根據標準曲線方程計算沉淀中殘留CUR和GSH的質量。

取100 μL待測脂質體，加400 μL PBS稀釋后，轉移到Millipore超濾管（截留分子質量為100 kDa）中，4 ℃、5 000 r/min離心10 min。向過濾器中加入500 μL PBS，將濃縮的樣品重新分散后再次離心10 min。經過分離和洗滌后，游離的CUR和GSH在收集管中回收，而包埋CUR和/或GSH的脂質體則被截留在過濾器中。將收集管中的溶液全部取出，用PBS定容至2 mL，加入等體積的氯仿，按照上述萃取步驟將溶液中的CUR萃取出來，使其與GSH分開。使用酶標儀測定CUR和GSH的吸光度，計算溶液中CUR和GSH的質量，最后按照式（1）計算CUR和GSH的包埋率：

式中：mtotal為制備脂質體時加入總CUR或GSH的質量/mg；mfree為計算出沉淀和收集液中游離CUR或GSH的質量/mg。

為了進一步確定脂質體中CUR和/或GSH的含量，過濾器中的脂質體通過反向旋轉的方法被重新回收，并通過萃取的方法測定了脂質體包埋CUR和/或GSH的量[19]。具體步驟：在截留管中加入500 μL PBS將濃縮的脂質體重新溶解，然后將倒置的過濾器置于干凈的收集管中并以5 000 r/min離心10 min，將收集管中的液體全部取出，用PBS定容至2 mL，加入等體積的氯仿，按照上述萃取法將脂質體中的CUR和GSH分離。測定CUR和GSH的質量，按照式（2）計算CUR和GSH的包埋率：

式中：me為脂質體中CUR或GSH的質量/mg。

1.3.4 測定CUR和GSH的體外釋放率

采用透析法對CLIP、AL-CH-CLIP、GLIP、AL-CHGLIP、CGLIP和AL-CH-CGLIP在體外釋放CUR或/和GSH的能力進行測定[20]。分別取2 mL不同樣品溶液于截留分子質量為3.6 kDa的透析袋中，將透析袋浸沒于50 mL含體積分數2%吐溫-80的PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）后，在37 ℃的恒溫搖床（100 r/min）中透析72 h。分別在0、3、6、12、24、48、72 h取5 mL透析液于15 mL離心管中，并向燒杯中補加5 mL新鮮的透析液，即含質量分數2%吐溫-80的PBS。在取出的透析液中加入等體積的氯仿，按照1.3.3節中描述的方法分離透析液中的CUR和GSH。測定透析液CUR和GSH的吸光度，計算透析液中二者的質量。根據式（3）計算CUR或/和GSH在不同時間點的體外釋放率：

式中：mi為i時間點透析液中累積釋放CUR或GSH的質量/mg。

1.3.5 粒徑、多分散系數（polymer dispersity index，PDI）和Zeta電位測定

分別取BLIP、CH-BLIP、AL-CH-BLIP、CLIP、CHCLIP、AL-CH-CLIP、GLIP、CH-GLIP、AL-CH-GLIP和CGLIP、CH-CGLIP、AL-CH-CGLIP樣品溶液1 mL，加入9 mL超純水稀釋后，測量各個脂質體樣品的平均粒徑、PDI和Zeta電位。測量時將折射率設置為1.330，吸收率設置為0.001，且每個樣品溶液循環測定10 次。

1.3.6 不同LIP的微觀形貌表征

采用負染法對CGLIP、CH-CGLIP和AL-CH-CGLIP的形貌進行表征[11]。將銅網格先放置在樣品溶液的液滴上4 min，然后用2%的磷鎢酸溶液染色4 min，用濾紙除去多余的液體后，在室溫下風干。最后，在120 kV電壓下用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察銅網。

1.3.7 FTIR表征

通過壓片法對樣品進行表征[21]。取CUR標準品、GSH、CH、AL、凍干的CGLIP、凍干的CH-CGLIP和凍干的AL-CHCGLIP樣品各2 mg，將樣品與適量的溴化鉀混合研磨成均勻粉狀，然后將粉末壓制成透明薄片，在4 000～500 cm-1范圍內對樣品進行掃描，測定樣品的透光率。

1.3.8 熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）

分別取10 mg凍干的CGLIP和AL-CH-CGLIP樣品進行TGA，比較二者的熱穩定性。溫度范圍為20～800 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氣體環境為氮氣。

1.3.9 差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）分析

采用DSC儀進一步對CGLIP和AL-CH-CGLIP的熱力學性質進行比較[11]。分別稱取10 mg凍干的CGLIP樣品和AL-CH-CGLIP樣品于鋁皿中，加蓋密封后，鋁皿在DSC中以10 ℃/min的速率從20 ℃加熱到140 ℃。同時，加熱一個密封的空鋁皿，作為參比。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 9 種LIP樣品中CUR和GSH的包埋率

包埋率是評價LIP載藥能力的重要指標之一。因為沉淀和收集管濾液均未檢測出CUR，而氯仿萃取的脂質體中CUR的量與制備時CUR的添加量基本一致，所以本研究得到的CUR包埋率為100%（圖1A）。另外，過濾器倒置后反向旋轉測定的結果與該結果一致。同時，與GSH共包埋對CUR的包埋率也沒有產生顯著影響（圖1B），這可能是因為在制備單包埋和共包埋的LIP時所添加的4 mg CUR均被包埋進了脂質體中或嵌入吸附在磷脂雙分子層上[22]。與已有文獻報道的結果（41%～90%）[23-25]相比，本研究中CUR的包埋率略高，產生差異的原因可能是磷脂的化學組成和結構不同，或是CUR與脂質體主要成分如大豆卵磷脂和膽固醇的質量比不同。經測定，單層CH修飾和雙層AL-CH修飾后，脂質體中CUR的包埋率沒有顯著差異，依然接近100%（圖1A、B）。

圖1 CUR和GSH在9 種LIP中的包埋率Fig.1 Encapsulation efficiency of CUR and GSH in nine LIPs

與CUR相似，兩種方法測定的GSH包埋率也基本一致。然而，與CUR共包埋以及多糖修飾對GSH在脂質體中的包埋率產生了顯著影響。由圖1C、D可以看出，隨著多糖修飾層數的增多，脂質體對GSH的包埋率逐漸增大（P＜0.05）。在單包埋GSH的脂質體中，GSH的包埋率先從7.90%（GLIP）增加到16.72%（CH-GLIP），再增加到37.52%（AL-CH-GLIP）。類似地，在CURGSH共包埋的脂質體中，GSH的包埋率先從27.03%（CGLIP）增加到了32.09%（CH-CGLIP），再增加到了41.22%（AL-CH-CGLIP）。脂質體對GSH的包埋率在兩種體系中均顯著增加的原因可能有兩個：一是CH與AL在層層自組裝到脂質體表面的過程中將溶液中部分游離的GSH一起包埋進去；二是經多糖修飾后脂質體更加穩定，減少了洗滌純化過程中GSH的損失[26]。在CUR和GSH共包埋時，未修飾、CH單層修飾和AL-CH雙層修飾的脂質體中GSH的包埋率均高于單包埋GSH脂質體，分別為單包埋GSH脂質體的4、2 倍和1.2 倍左右。因此，脂質體同時包埋疏水性CUR和親水性物質也許可以提高其對親水性物質的包埋能力，且該現象可以通過CUR對磷脂雙分子層結構的影響解釋。研究表明，CUR能夠以跨雙分子層的方向插入脂質雙分子層深處，并通過與脂質的磷酸基團形成氫鍵固定[27]，而CUR的插入可以使脂質體的?；渽^域緊致，使脂質體膜的通透性降低，減少GSH在制備、離心、洗滌等過程中泄漏[28]。另外，多糖修飾對GSH包埋率的影響可能遠遠大于與CUR共包埋對GSH包埋率的影響，所以AL-CH-CGLIP與AL-CH-GLIP對GSH的包埋率相差不大。

2.2 平均粒徑、PDI和Zeta電位分析

雖然脂質體具有生物相容性好、能同時包埋疏水性和親水性物質等優點，但是脂質體的穩定性差，顆粒之間容易黏結，從而產生粒徑變大、絮凝、內容物泄漏等問題，而脂質體是否會出現上述問題與其粒徑大小、粒徑分布及Zeta電位等膠體性質緊密相關[22]。脂質體粒徑的大小影響其分散和通透性，當PDI小于0.3時，通常認為體系具有較好的分散性[11]。另外，無論脂質體帶正電荷還是負電荷，脂質體帶電荷的絕對值越大，其穩定性越強，泄漏率越低[18]。

由圖2、3可知，BLIP、CLIP、GLIP和CGLIP的平均粒徑分別為（95.02±1.93）、（87.30±0.91）、（117.77±1.00）nm和（132.47±18.14）nm，PDI分別為0.200±0.023、0.146±0.007、0.184±0.008和0.317±0.011，Zeta電位分別為（-22.47±1.96）、（-24.80±0.29）、（-15.67±0.67）mV 和（-14.70±0.46）mV。4 種LIP溶液的PDI均較?。ㄐ∮?.35），說明它們的粒徑大小都比較均勻[22]。與BLIP相比，CLIP的平均粒徑減小了7.7 nm，而Zeta電位沒有明顯變化。CUR分子的高共軛結構使其具有較強親脂性，在大豆卵磷脂形成雙分子層過程中，CUR可能深深插入到雙分子層內部，誘導脂質體的?；渽^域更加緊致，而不是吸附在脂質體表面，導致CLIP粒徑略微減小而表面電荷沒有發生明顯變化[28]。相反地，GLIP的平均粒徑增加了約13 nm，Zeta電位增加了約7 mV，表明GSH被包埋進脂質體水相空腔，且可能有部分GSH吸附在脂質體表面。GSH溶解于pH 6的PBS中，pH值接近于GSH的等電點（5.93），GSH本身僅帶有微弱的負電荷，因此，GSH除了被包埋進脂質體內部的水相空腔，還可能通過氨基與磷酸根之間形成氫鍵或范德華力等分子間相互作用吸附在脂質體表面，這個推論可以由FTIR分析結果證實。與BLIP相比，CGLIP平均粒徑增加了37.45 nm，Zeta電位增加了約8 mV，這可能是因為GSH與CUR共包埋時，更多GSH被包埋進了脂質體內，且也有部分GSH吸附在脂質體表面，與前面包埋率分析的結果一致。類似地，梁曉飛等[29]報道殼聚糖季銨鹽乙醇脂質體共載長春新堿和消炎痛后，脂質體的粒徑和Zeta電位也略有增加。

圖2 12 種LIP的平均粒徑及PDIFig.2 Average particle sizes and PDI of 12 LIPs

圖3 12 種LIP的Zeta電位Fig.3 Zeta potentials of 12 LIPs

經CH單層修飾后，CH-BLIP、CH-CLIP、CH-GLIP和CH-CGLIP的平均粒徑分別為（116.37±4.80）、（115.93±1.60）、（123.33±1 8.04）nm 和（151.90±1.80）nm，Zeta電位分別為（0.77±1.08）、（5.98±0.36）、（7.49±0.49）mV和（9.00±0.68）mV；經AL-CH 雙層修飾后，AL-CH-BLIP、AL-CH-CLIP、AL-CH-GLIP和AL-CH-CGLIP的平均粒徑分別為（133.23±16.26）、（130.50±1.93）、（149.87±12.25）nm和（161.97±5.58）nm，Zeta電位分別為（-43.93±2.08）、（-39.07±1.64）、（-38.23±2.41）mV和（-40.87±1.79）mV。因此，脂質體的Zeta電位經多糖修飾后先由負變為正，再由正變為負，這說明CH和AL通過靜電相互作用依次自組裝到脂質體的表面。該結果與本課題組之前報道的結果[11,16]一致。另一方面，隨著多糖修飾層數的增多，脂質體的粒徑逐漸增大（P＜0.05），PDI也明顯增大，特別是經CH修飾后，脂質體的最大PDI約為0.9，這可能是因為此時脂質體Zeta電位的絕對值最小，導致其穩定性最差，顆粒之間容易發生交聯，使得粒徑分布不均勻。雖然LIP粒徑分布的均勻程度減弱，但該結果再次證明CH和AL修飾到了脂質體表面，而且相比于CH單層修飾的脂質體，AL-CH雙層修飾的脂質體具有更強的穩定性。這與朱雨晴等[21]的研究結果相似。

2.3 不同LIP對CUR和/或GSH的體外釋放率

如圖4所示，所有類型的納米脂質體都具有緩慢釋放CUR或/和GSH的作用。但是經AL-CH雙層修飾后，納米脂質體對CUR和GSH的釋放率更小，具有更好的緩釋作用。透析72 h后，AL-CH-CLIP和CLIP對CUR的釋放率分別為8.4%和14.6%，AL-CH-GLIP和GLIP對GSH的釋放率分別為32.7%和51.2%，AL-CH-CGLIP和CGLIP對CUR的釋放率分別為9.1%和13.4%，對GSH的釋放率分別為30.6%和31.4%。因此，AL-CH雙層修飾的納米脂質體對CUR和GSH的緩釋作用優于未經修飾的納米脂質體。這可能是AL、CH和磷脂膜兩兩之間具有較強的靜電相互作用，增加了脂質體納米顆粒的膠體穩定性，從而減緩了CUR和GSH的釋放速率。這與Yu Shaoxuan[11]和朱雨晴[21]等的研究結果一致。與CUR或GSH單包埋的納米脂質體相比，當CUR和GSH共包埋時，納米脂質體對CUR的釋放率沒有顯著影響，但GSH的釋放率減小了。這可能是因為CUR的嵌入能夠增加磷脂雙分子層碳氫鏈堆積的有序性和剛性，提高納米脂質體的穩定性。另外，AL-CHGLIP在前6 h對GSH的釋放率高于GLIP，AL-CH-CGLIP在前12 h對GSH的釋放率高于CGLIP，可能是由多糖復合到脂質體表面的過程中包埋的GSH引起。這部分GSH吸附在脂質體表面，很容易被釋放，而包裹在脂質體內部的GSH比較難釋放[11]。

圖4 6 種納米脂質體在體外緩慢釋放CUR（A、C）和/或GSH（B、D）的能力Fig.4 In vitro sustained release capacity of CUR (A and C) and/or GSH (B and D) loaded in six LIPs

2.4 不同納米脂質體的微觀形貌

如圖5A所示，CGLIP是規則的球形顆粒，很好地分散在觀察視野中，核為中空、殼為白色明亮的雙分子層，粒徑在40～100 nm范圍內變化[18]。CH-CGLIP也是比較規則的球形顆粒（圖5B），粒徑分布在75～155 nm范圍內。但是CH-CGLIP顆粒之間有比較明顯的聚集，這可能與其表面電荷的含量相對較少有關，與前面Zeta電位和PDI測定的結果相印證。而且CH-CGLIP周圍有強烈的染色痕跡，這可能是磷鎢酸與帶正電的CH離子結合引起。磷鎢酸是一種陰離子染色劑，可與脂質結構中帶正電荷的部分結合[11]。而AL-CH-CGLIP的形狀變得不規則（圖5C），粒徑分布在90～180 nm之間。相對于CGLIP，CH-CGLIP和AL-CH-CGLIP的粒徑明顯增大，與粒度分析儀的測定結果一致。

圖5 CGLIP（A）、CH-CGLIP（B）和AL-CH-CGLIP（C）的TEMFig.5 TEM micrographs of CGLIP (A),CH-CGLIP (B) and AL-CH-CGLIP (C)

2.5 納米脂質體的組成及其相互作用

磷脂的存在可以通過以下幾個官能團特征峰的出現進行表征：位于3 000～2 800 cm-1范圍內的由于丙烯鏈對稱和不對稱CH2伸縮振動產生的特征峰，位于1 765～1 720 cm-1之間的由于C＝O伸縮振動產生的特征峰，位于1 200～1 145 cm-1之間的由于P＝O對稱振動產生的特征峰，以及位于1 145～970 cm-1范圍內由于P—O—C對稱振動產生的特征峰[16,25,28]。如圖6所示，在CGLIP的光譜中，CH2的對稱和不對稱伸縮振動特征峰出現在2 926 cm-1和2 855 cm-1處，C＝O的伸縮振動特征峰出現在1 741 cm-1處，但是P＝O的對稱振動特征峰出現在1 245 cm-1處，發生了藍移，這可能是因為CUR和GSH的存在導致。但CUR的很多特征峰在CGLIP的光譜中沒有出現，如酚羥基伸縮振動的特征峰（3 515 cm-1處）、C＝C環和C＝O振動重疊產生的特征峰（1 508 cm-1處）以及烯醇結構中C—O振動產生的特征峰（1 270 cm-1處）等，而位于1 185、1 119、1 154 cm-1和1 026 cm-1處的特征峰強度也明顯減小，表明CUR主要被包埋進脂質體雙分子層中，有極少游離的CUR可能吸附在脂質體表面[30]。GSH的很多特征峰（如位于2 522、1 710、1 555、811 cm-1處分別由硫醇基團中S—H伸縮振動、羧基中C＝O伸縮振動、仲酰胺基團C—N伸縮振動和C—S伸縮振動產生的吸收峰）在CGLIP的光譜中也沒有觀察到，但出現了位于3 400到2 700 cm-1處由于O—H和N—H的伸縮振動及其重疊產生的多重吸收峰，強度明顯減弱，表明GSH主要被包埋在脂質體內部，部分游離的GSH可能吸附在脂質體表面[31]。對比CH-CGLIP、ALCH-CGLIP和CGLIP的光譜，可以發現大豆卵磷脂的丙烯鏈對稱和不對稱CH2伸縮振動產生的特征峰和P＝O對稱振動產生的特征峰位置基本保持不變，但峰強度明顯減小，初步證明CH和AL覆蓋在脂質體的表面。另外，在CH-CGLIP的光譜中觀察到CH的特征峰酰胺I帶（1 656 cm-1處），且該峰的位置發生輕微的偏移[32]。結合前面磷酸基團特征峰的偏移和強度變換，進一步證明CH通過靜電相互作用成功修飾在脂質體表面。CH位于1 255 cm-1處代表C—O的特征峰在CH-CGLIP中沒有出現，且3 500 cm-1處的特征峰發生了紅移，表明CH還可能通過分子間氫鍵的形成與脂質體的磷脂結合[32]。然而，在AL-CH-CGLIP中，CH的酰胺I帶特征峰和AL的羧基特征峰（1 617 cm-1處）都沒有出現，表明AL主要通過靜電相互作用與CH結合，修飾在納米脂質體上，與先前報道的結果[16,33]一致。

圖6 AL-CH-CGLIP、CH-CGLIP、CGLIP、CUR、GSH、CH和AL的FTIRFig.6 FTIR spectra of CGLIP,CH-CGLIP,AL-CH-CGLIP,CUR,GSH,CH,and AL

2.6 CGLIP和AL-CH-CGLIP的熱穩定性

如圖7A所示，CGLIP和AL-CH-CGLIP的質量損失大致分為3 個階段。在20～150 ℃范圍內，CGLIP和ALCH-CGLIP的質量損失率分別為4.62%和7.08%。因為在該溫度范圍內的質量損失主要是由水分蒸發散失引起，所以結果表明AL-CH-CGLIP在加熱過程中散失的水分多于CGLIP散失的水分，這可能是因為AL和CH分子結構中存在的—OH、—COOH和—CONH等官能團結合了較多水分[34]。在150～500 ℃范圍內，CGLIP和AL-CH-CGLIP在質量損失率分別為56.95%和52.02%，這主要是由納米脂質體的主要成分卵磷脂、膽固醇、CUR、GSH、CH和AL分解造成，結果表明CGLIP在加熱過程中的分解程度略高于AL-CH-CGLIP[35-36]。在溫度高于500 ℃時，CGLIP和AL-CH-CGLIP均出現了緩慢的質量損失，這是由樣品碳化導致?？傮w而言，CH-AL修飾的脂質體在加熱過程中的質量損失明顯低于未修飾的脂質體，表明CH-AL雙層修飾可以在一定程度上增加脂質體的熱穩定性。

圖7 CGLIP和AL-CH-CGLIP的TGA（A）和DSC（B）分析圖譜Fig.7 TGA (A) and DSC (B) profiles of CGLIP and AL-CH-LIP

如圖7B所示。一般大分子物質的DSC曲線不會出現尖銳的峰，只會出現緩慢而平滑的峰。CGLIP和ALCH-CGLIP的DSC曲線均出現一個寬的吸熱峰，峰值分別位于88.42 ℃和91.42 ℃。與之前報道的結果[11,25]相比，CGLIP吸熱峰出現的溫度稍高于空脂質體和單包埋CUR的脂質體，表明在該條件下CUR和GSH共包埋可能增加了納米脂質體的熱穩定性，這與侯麗芬等[36]研究結果相似。與CGLIP相比，AL-CH-CGLIP的吸熱峰向溫度升高方向發生了偏移，這表明AL-CH存在于AL-CH-CGLIP的外層，可以增強它們對溫度的抵抗力，與TGA的結果一致。另外，Liu Yujia等[25]也發現組裝在CUR脂質體表面的CH在高溫條件下可以對脂質體起到保護作用，減少CUR泄漏。

3 結論

本研究制備了同時包埋CUR和GSH的納米脂質體，并通過靜電相互作用將CH和AL依次修飾到了納米脂質體的表面，以增強納米脂質體的穩定性。結果表明，與GSH共包埋、CH單層修飾或AL-CH雙層修飾對CUR的包埋率均沒有顯著影響；但與CUR共包埋時，GSH的包埋率從7.90%（GLIP）增加到了27.03%（CGLIP），且經多糖修飾后，GSH的包埋率進一步增加到了32.09%（CH-CGLIP）和41.22%（AL-CH-CGLIP）。與BLIP、CLIP和GLIP相比，CGLIP的平均粒徑和Zeta電位略有增加；隨著多糖修飾層數的增多，脂質體的平均粒徑也逐漸增大，但與CH單層修飾的脂質體相比，AL-CH雙層修飾的脂質體的Zeta電位絕對值更大，具有更高的分散穩定性。在37 ℃振蕩孵育的條件下，CGLIP和AL-CH-LIP對CUR的釋放率都明顯高于對GSH的釋放率，而且ALCH-CGLIP對CUR和GSH的緩釋作用都優于CGLIP。另外，AL-CH-CGLIP在加熱過程中的變性溫度略高于未修飾的脂質體而質量損失率明顯低于未修飾的脂質體，表明AL-CH雙層修飾可以在一定程度上增加脂質體的熱穩定性。本研究闡明了CUR和GSH共包埋以及AL-CH雙層修飾對納米脂質體的包埋率、緩釋作用和穩定性的影響，可為同時包埋疏水性和親水性活性物質的新型功能食品或藥品開發提供一定參考價值。