非生物型人工肝技術的優化與生物型人工肝研究進展

周 莉， 楊顏榕， 陳 煜

首都醫科大學附屬北京佑安醫院肝病中心四科（疑難肝病及人工肝中心）， 肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室， 北京 100069

肝衰竭是一種臨床常見的綜合征，以多種因素引起嚴重的肝功能損傷為特征，以黃疸、凝血功能障礙、肝腎綜合征、肝性腦病、腹水為主要臨床表現，病死率極高［1］，肝移植是其唯一的治愈方法。中國肝移植注冊中心數據表明，2018—2020 年我國平均每年肝移植約6 000 例［2］。目前尚無官方統計數據顯示肝衰竭的患病人數，據估計，臨床上每年肝衰竭患者實施肝移植的比例低于2%［3］。肝源緊缺、肝移植費用昂貴等原因使肝移植并不能在臨床廣泛使用?，F有研究證明，人工肝支持系統（artificial liver support system， ALSS）可以通過體外裝置暫時替代肝臟的部分功能，有效清除肝衰竭患者體內毒素及炎癥介質，為肝細胞再生創造條件，為肝功能恢復及肝移植爭取時機，是肝衰竭的有效治療方法。人工肝技術分為生物型、非生物型及混合型，目前在臨床上廣泛應用的是非生物型人工肝（non-biological artificial liver，NBAL），其包括血漿置換（plasma exchange， PE）、血液/血漿灌流、雙重血漿分子吸附系統（double plasma molecular absorption system，DPMAS）、血液透析濾過（hemodiafiltration，HDF）、血漿透析濾過（plasma diafiltration，PDF）、分子吸附再循環系統（molecular absorbent recirculating system，MARS）等模式［4］。生物型人工肝（biological artificial liver，BAL）能更好地模擬肝臟的合成、解毒、代謝等生物學功能。隨著科學技術的發展，種子細胞來源、培養及生物反應器的構建等相關技術都取得實質性的進展，BAL 相關臨床研究也在積極開展。本文針對NBAL技術的優化及BAL 的相關進展進行總結和探討，以期對未來人工肝技術的臨床應用與研究提供參考。

1 NBAL治療的時機

肝衰竭進展快速，預后不佳?！陡嗡ソ咴\治指南（2018年版）》［1］指出人工肝治療肝衰竭的總體原則為“早診斷、早治療”，具體治療時機還應根據疾病的病理生理特點及病情的動態變化進行選擇。ALSS 在前、早、中期肝衰竭患者中的使用已在《人工肝血液凈化技術臨床應用專家共識（2022年版）》中得到認可［5］，其有效性也在臨床研究中得到驗證。Li等［6］對ALSS 治療HBV 相關慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）進行Meta分析，結果顯示ALSS治療的患者28天、90天和270天總生存率高于標準治療組。有學者［7-8］對早期、中期的HBV-ACLF患者分別進行了研究，發現早期HBV-ACLF患者通過DPMAS序貫低劑量PE 治療后4 周總體生存率顯著升高，而中期HBVACLF患者治療后4周總體生存率無明顯改善，這表明在HBV-ACLF患者中人工肝治療應盡早開始。

大量研究表明，PE 可以改善急性肝衰竭（ALF）、ACLF 患者的預后。在全病因ACLF 患者中，PE 對ACLF 2 級患者預后的改善優于ACLF 1 級和ACLF 3 級［9］。在HBV-ACLF 患者中，基于PE 的ALSS 治療同樣對ACLF 2級患者生存率有顯著改善［10］。ACLF 1 級患者的肝功能在經過標準內科治療后有可能會恢復，對其進行PE 治療并不能實現最大獲益；ACLF 3級患者因器官衰竭數量多，故PE 治療效果欠佳。PE 在ACLF 2級患者中使用可實現最大獲益。

終末期肝病模型（model for end-stage liver disease，MELD）評分不同的患者PE 治療效果也有差異。MELD評分在30～40分的HBV-ACLF 患者經過以PE 為基礎的ALSS 治療生存率改善最為顯著［9］。吳慧慧團隊［11］以MELD評分中位數為界限將HBV-ACLF患者分為高評分組和低評分組，并評估兩組患者ALSS 治療效果，結果顯示，低評分組臨床癥狀較高評分組患者明顯改善。

筆者研究團隊［12］基于ACLF 的動態變化提出新的臨床分型，將其分為5種類型，其中A型快速進展型病情進展較快，人工肝治療效果較差或沒有干預時機；B型快速恢復型可能不需要人工肝治療或較少次數的人工肝治療即可恢復；C 型緩慢進展型依賴人工肝治療的次數較多，但效果可能不理想，應爭取多次人工肝治療，為肝移植爭取時間；D型緩慢恢復型人工肝治療效果好，應加強人工肝治療；E 型緩慢持續型患者接受人工肝治療后病情可能會加快恢復，但療效不肯定，應根據患者的自身條件選擇人工肝治療次數。

林建輝團隊［13］對PDF 的治療時機進行回顧性研究，結果顯示，在肝衰竭患者的治療過程中，72 h 后啟動PDF 治療會增加發生院內不良預后的風險，且這種風險隨著時間的延長逐步增加，即患者確診HBV-ACLF 后超過72 h 啟動PDF 治療，每增加1 h，院內不良結局風險增加4%，這提示對HBV-ACLF 患者72 h 內啟動PDF 治療能夠改善預后。安薪宇團隊［14］根據臨床表現及實驗室檢查將ACLF 患者分為好轉組和惡化組，分別比較ALSS治療前兩組患者的細胞因子水平，發現好轉組的人β防御素-1（human beta-defensin-1， HBD-1）、干擾素-α（interferon， IFN-α）水平明顯低于惡化組，甲胎蛋白水平明顯高于惡化組，進而分析發現 HBD-1、IFN-α 和甲胎蛋白為ACLF患者短期預后的獨立危險因素，ACLF患者HBD-1、IFN-α 水平越高，甲胎蛋白水平越低，預后越差。臨床醫生可根據ACLF患者血清中的細胞因子水平評估患者的短期預后，在排除感染后盡早啟動人工肝治療。

肝衰竭患者的ALSS 治療需要臨床醫生具備豐富的經驗，依據“早診斷、早治療”的總體原則，結合患者的疾病進程、嚴重程度，應用各種預后預測模型，根據疾病動態演變評估患者預后，選擇恰當治療時機，為患者爭取最大獲益。

2 NBAL的模式及其優化

2.1 PE 及其優化 PE 能改善肝衰竭患者的預后，有研究［15］將PE 與成分血漿分離吸附系統比較，發現PE 能改善全身炎癥反應綜合征，延緩多臟器功能衰竭，提高30 天生存率。也有研究［9］表明，與標準療法相比，PE 能提高ACLF患者30天生存率，但其對90天生存率無明顯改善。一項Meta 分析［16］顯示，在全病因ACLF 患者中，PE組相較于標準治療組3個月總體生存率顯著升高。

根據目標清除物的半衰期及清除率，有學者［17］提出了高容量血漿置換（high-volume plasma exchange， HVPE）。與標準內科治療相比，HVPE 能改善ALF 患者的無移植生存率，同時也能減輕炎癥和降低序貫器官衰竭（sequential organ failure assessment， SOFA）評分。該研究并未將HVPE 與PE 比較，故HVPE 的有效性還需要進一步探討。

由于新鮮冰凍血漿中含枸櫞酸偏堿性，因此單純PE可能會加重肝性腦病，且單純PE 治療對水溶性毒素清除效果差，優化PE 的治療模式是非常有必要的。PE 聯合血漿灌流能顯著改善肝性腦病等并發癥，促進器官功能恢復，延緩器官衰竭及并發癥的發生，提高HBV-ACLF患者的28 天和90 天生存率，其對出現兩種及以上器官衰竭和并發癥的患者生存率提高更加顯著［18］。

目前血漿資源日趨緊張，這也成為PE 受限的原因之一，使用安全的代血漿制品是有效的解決方法。臨床常用的血漿替代品包括人血白蛋白、羥乙基淀粉、右旋糖酐及晶體液等。筆者團隊［19-20］的研究表明在使用PE治療肝衰竭患者時，應用血漿+羥乙基淀粉作為置換液可以提高治療后即刻膽紅素的清除率，但其對治療后膽紅素的反彈幅度無明顯改善，同時會造成白蛋白減少，在治療后應注意及時補充白蛋白；血漿緊缺時，除了在PE初始階段采用血漿代用品以外，還可以根據具體情況采用吸附、灌流、濾過、成分血漿分離（如PDF）、半量PE聯合DPMAS、無血漿模式血液置換、基于基線生化指標可調節的人工肝組合模式等方法。

2.2 HDF 及其優化 HDF 將血液濾過和血液透析綜合起來，通過彌散清除小分子物質、對流超濾中分子物質，能有效清除血液中的有害物質，其作用效果與透析液的流速有關。一項日本的研究［21］比較了不同透析液流速的HDF對暴發性肝炎的影響，在PE 治療的基礎上，透析液流速為500 mL/min的患者意識恢復率高于300 mL/min的患者，采用高容量透析液的在線血液透析（on-line hemodiafiltration，OLHDF）患者意識恢復率可達92.9%。在生存率方面，透析液流速為500 mL/min 的治療模式和OLHDF 也體現出了優勢。新型人工肝模式在線連續血液透析濾過對血氨、尿素氮、肌酐都有顯著的改善作用，可以促進ALF 伴肝性腦病患者意識恢復，但對生存率的影響仍不明確。同時，該模式中透析液可以當作置換液，能在一定程度上節省費用，但其對操作的無菌要求更高［22］。

2.3 PDF 及其優化 PDF 將選擇性PE 與透析結合起來，選擇不同蛋白篩選系數的血漿成分分離器，濾過部分蛋白結合毒素及水溶性中小分子溶質，同時補充凝血因子等生物活性物質［5］。研究［23］顯示，連續性血漿透析濾過（continuous plasma diafiltration， CPDF）能改善ALF 患者的肝功能，并對腎臟、肺和血流動力學產生有益的影響，改善SOFA 評分，這表明CPDF 可用于伴有血流動力學不穩定的ALF 患者。筆者團隊［24］的研究顯示在不影響治療有效性及安全性的前提下，PDF 治療4 h 和6 h 的患者膽紅素和轉氨酶下降均無統計學差異，提示臨床工作中可通過縮短PDF的治療時間以增加患者的耐受性。

2.4 DPMAS 及其優化 DPMAS 是一種不需要外源性血漿的NBAL模式，可以清除血漿中的膽紅素、炎癥介質及肝性腦病相關毒素。與PE 相比，接受DPMAS 治療的HBV-ACLF患者其12周生存率無明顯差異［25］，但DPMAS的優勢在于不受外源性血漿來源的限制。DPMAS 無法補充凝血因子而PE 可以補充凝血因子，PE 有加重肝性腦病的風險而DPMAS可以清除肝性腦病相關毒素，故這兩種模式可以互相取長補短，DPMAS 序貫PE 目前也成為臨床常用的人工肝組合模式。DPMAS 序貫低流量PE不僅可以降低治療費用、減少血漿用量，同時在降低膽紅素、改善凝血功能方面均優于內科治療組，其12 周的累積生存率亦高于內科治療組［8］。DPMAS 序貫半量PE 相較于PE 可能更有效地降低ACLF 患者的膽紅素并節省血漿，減少膽紅素反彈，提高HBV-ACLF 中晚期患者的28天生存率［26］。在HBV-ACLF患者中，DPMAS+PE 治療組28 天好轉率和12 周存活率均顯著高于血漿膽紅素吸附+PE組［27］。

2.5 MARS 及其優化 MARS 是一種基于白蛋白透析的人工肝治療模式，雖能夠有效降低水溶性毒素，對穩定血流動力學有積極作用，但對于患者遠期預后的改善效果仍不明確。同時，由于其需要大量白蛋白，耗材費用較高，且主機需要與透析或血濾機配合使用，故沒有在國內廣泛使用。

歐洲的DELPHI 共識［28］對MARS 治療肝衰竭的安全性及有效性予以認可。在對乙酰氨基酚引起的ALF患者中使用MARS 療法可改善其21 天預后。在全病因ALF患者中，MARS能使水溶性毒素、親脂性物質及炎癥因子減少，改善肝性腦病，穩定血流動力學，治療頻率≥3次時效果較顯著，但其并不能改善6～12個月生存率，且不建議在晚期合并多器官衰竭的ALF 患者中使用。該共識推薦在對特利加壓素和白蛋白治療無反應的肝腎綜合征患者，及24～48 h 標準治療后仍有肝性腦病的失代償性肝硬化、ACLF、繼發于ACLF 的進行性膽汁淤積患者中使用MARS人工肝治療，但也指出其對28天及90天預后無明顯改善。一項單中心研究［29］結果證實了MARS能顯著降低總膽紅素，改善ACLF 和ALF 患者的肝性腦病。目前許多研究顯示MARS 可以有效降低肝衰竭患者的血清學指標并改善肝性腦病的嚴重程度，其對21天生存率的改善作用也被認可，但其遠期預后是否改善仍不明確，這可能與肝衰竭患者病情危重，肝功能恢復較慢有關。

2.6 新型的人工肝技術 DIALIVE 是一種基于ACLF病理生理機制開發的新型人工肝技術，能夠去除功能失調的白蛋白并補充等量白蛋白，也能吸附內毒素和炎癥因子。歐洲學者［30］通過研究以酒精性肝病為基礎的ACLF 患者，發現相比于標準治療，DIALIVE 可以改善白蛋白功能，促進ACLF 恢復，同時縮短治療時間。在治療第10 天進行評估，DIALIVE 可顯著降低患者CLIF-C OF評分和CLIF-CACLF評分，但該研究并沒有表明DIALIVE能否改善預后，這是需要進一步探討的問題。

CytoSorb是一種體外血液凈化裝置，主要用于感染性休克和其他炎癥性疾病，有學者指出ALF 是其使用的第三大適應證，可以大量清除膽紅素?；诖擞^點，Popescu等［31］將CytoSorb 與MARS 進行對比，發現其在降低膽紅素和轉氨酶方面確有優勢，能夠改善肝功能，但同時也會造成血小板和血紅蛋白下降。新型人工肝技術還需要在更多的臨床應用中去驗證其有效性及安全性。

2.7 抗凝方案的優化 肝衰竭患者凝血功能差，使用抗凝劑會增加出血風險或誘導血小板減少。目前主要的抗凝方式包括全身肝素抗凝、體外肝素抗凝和低分子肝素抗凝在內的肝素抗凝法及局部枸櫞酸抗凝法。枸櫞酸抗凝在肝衰竭患者人工肝治療中的應用曾有較大爭議，白浪教授團隊［32］在應用DPMAS+PE 治療肝衰竭患者時發現，相較于肝素抗凝，局部枸櫞酸抗凝導致陰離子間隙水平顯著變化，發生枸櫞酸蓄積可能性更高，但兩組患者的酸堿狀態改變趨勢并無顯著差異，局部枸櫞酸抗凝對DPMAS+PE 治療肝衰竭患者有效且安全，但如果存在嚴重低氧血癥（動脈氧分壓＜60 mmHg）和組織灌注差（血壓＜90/60 mmHg），則不推薦使用枸櫞酸抗凝［5］。白浪教授團隊［33］在后續研究中發現，PE 聯合血漿吸附治療的HBV-ACLF 患者中，是否發生枸櫞酸蓄積并不是影響90天預后的獨立危險因素，患者自身肝病的嚴重程度對預后影響更大。已有Meta 分析［34］顯示人工肝治療中局部枸櫞酸抗凝對肝衰竭患者是有效且安全的。在人工肝治療中，應根據患者病情制訂個體化的抗凝方案，在治療過程中密切檢測、及時調整抗凝劑量有助于降低并發癥的風險，局部枸櫞酸抗凝可以作為人工肝治療肝衰竭的抗凝新選擇。

此外，筆者團隊［35］對新型抗凝劑萘莫司他在人工肝中的應用進行了探索，研究結果顯示萘莫司他在DPMAS治療過程中抗凝效果良好，具有局部抗凝的特點，對人體凝血功能的影響小，出血風險小，安全性好。

3 BAL研究現狀與進展

NBAL 雖然能在一定程度上替代肝臟的解毒功能，但無法進行合成代謝。對比傳統的NBAL，BAL 在理論和應用方面具有良好的潛力，不僅可以吸附、代謝有毒物質發揮解毒作用，且能模擬肝臟合成蛋白質等有益物質，促進肝臟恢復，其主要包括種子細胞、生物反應器和輔助體外循環裝置三個部分。目前，BAL 技術蓬勃發展，得到了國內外學者的廣泛關注，種子細胞的來源與培養、生物反應器的研發已經有了實質性進展，BAL 技術有巨大的臨床潛力及光明的發展前景。

BAL 的關鍵在于種子細胞，種子細胞來源發展差異較大。動物源性肝細胞（通常是豬肝細胞）已經應用于早期的BAL 系統，但其有病毒感染的風險，目前已被歐洲禁用［3］。腫瘤來源的肝細胞主要有HepG2 細胞系、HepaRG 細胞系和C3A 細胞系，其中C3A 細胞系已經被應用于ELAD系統并進行臨床試驗。腫瘤來源的肝細胞可在體外大量培養，以滿足BAL 細胞播種密度的要求，但如果發生泄漏就會有致癌的風險。人原代肝細胞（primary human hepatocytes， PHH）被認為是最優質的細胞來源，但其來源有限，體外培養不易且可能會失去生物學功能。目前，已有團隊研制出新的培養基，能夠實現PHH 體外大量擴增［36］。永生化的肝細胞是將永生化基因導入PHH生成的細胞系，能夠解決PHH在體外大量增殖受限的問題。其中永生化的肝前體樣細胞（iHepLPC）已經被應用于BAL 并進行動物實驗。多能干細胞能夠被誘導分化為成熟肝細胞，但其生產過程昂貴又費時，還需要穩定的生物反應器維持細胞表型及生物活性。施曉雷教授團隊［37］提出了一種新型的仿生BAL，使用了多能干細胞衍生肝細胞（hiPSC-Hep），并在ALF兔模型中較好地模擬了肝細胞的功能。直接將人成纖維細胞重新編程為肝細胞，可以快速生成具有成熟功能和高度擴展性的人源誘導肝樣細胞（hiHep），該細胞系應用于BAL 治療ALF豬模型的安全性和有效性已經被證明［37］。

生物反應器是BAL 的另一核心要素，在維持細胞穩定增長、保證細胞正常發揮功能方面具有重要作用。常見的反應器有中空纖維反應器、灌流/支架式反應器、微囊懸液式反應器和平板型生物反應器，各種反應器各有利弊。中空纖維反應器有內腔和外腔，細胞黏附于外腔，通過生物膜與血液進行物質交換。這種方式能降低血液灌注對肝細胞的剪切力，避免異種細胞間發生免疫反應，但同時也會造成細胞分布不均，物質交換效率下降的問題。目前臨床研究中的ELAD和HepAssis2?都是基于中空纖維反應器構建的。灌流/支架式反應器借助灌注床或支架培養肝細胞，使細胞與血液直接接觸，增加了物質轉運，促進三維結構的形成，能容納更多細胞，但該反應器中血液灌注不均勻，易發生堵塞。微囊懸液式反應器使用半透膜將肝細胞包裹起來制作成多孔微膠囊，然后進行灌注培養，其優點是所有細胞的微環境相同，有大量細胞培養的空間，免疫隔離效果好；缺點是細胞穩定性差，物質交換能力差［3，38］。平板型生物反應器是將細胞種植在平板上培養，其優點是細胞分布均勻，微環境一致，血漿成分和細胞直接接觸，物質交換能力在幾種結構中最高，但表面積與體積之比下降，細胞承載能力低，可能存在剪切力大及免疫損傷肝細胞的風險。

目前，有多家研究中心開展對BAL 的研發。ELAD是一種以C3A 肝癌細胞系為種子細胞的BAL，使用中空纖維型反應器，已在多項臨床試驗中被使用。一項國內的隨機多中心研究［39］對ELAD 的有效性及安全性進行評估，該研究以ACLF 患者為基礎，所有患者均接受PE和血液濾過治療，ELAD 組后續接入ELAD 治療，對照組為標準內科護理。結果顯示，ELAD 能夠顯著清除膽紅素并改善28天無肝移植生存率，且在患者中表現出良好的耐受性。國外學者［40］以酒精性肝炎患者為基礎研究ELAD 的有效性，結果顯示ELAD 組相較于標準治療組并沒有明顯改善總體生存率。相比于國外的研究，國內研究納入的ACLF患者大多以乙型肝炎為病因，ELAD對生存率的影響可能與患者的疾病基礎相關，還需要更多的臨床研究去驗證。

HepAssis2?以HL2細胞為種子細胞，該人工肝技術使用中空纖維式反應器。HL2細胞是一種非誘導自發性人源永生化肝細胞系，具有良好的肝功能和極強的增殖能力。武漢的研究團隊以肝衰竭人群為基礎研究HepAssis2?的有效性，結果顯示該技術能更好地降低膽紅素水平，減少膽紅素反彈，顯著改善患者的無移植生存率。

鄢和新教授團隊［41］研發了以iHepLPC 為種子細胞、以支架反應器為載體的Aliver 人工肝系統，該系統實現了iHepLPC 在體外的大量擴增，保持了肝細胞的生物學功能，在治療ALF 豬模型過程中達到了積極的效果。結果顯示，Aliver 可合成尿素，代謝血氨，分泌肝細胞生長因子、白蛋白等，促進了肝細胞再生和肝臟恢復，顯著提高動物存活率。

惠利健教授團隊［42］設計了以hiHep 為種子細胞的人工肝系統hiHep-BAL，其能夠改善ALF豬的肝功能，進而提高存活率。該團隊后續的研究［43］顯示，hiHep-BAL治療在肝切除術后肝衰竭動物模型中有顯著的存活益處，能夠促進肝功能恢復及肝臟再生。將hiHep-BAL 用于治療7 例行擴大肝切除術的患者，發現患者對治療耐受性良好?；谇捌诘难芯砍晒?，使用多層平板生物反應器的HepaCure人工肝系統得以研發。近期，首都醫科大學附屬北京佑安醫院開展了首例HepaCure 的臨床研究，結果顯示，HBV-ACLF患者對內科治療聯合HepaCure耐受性良好，且在14天的隨訪觀察期間沒有發生嚴重不良反應，肝功能及凝血指標逐漸好轉。

4 總結

隨著科學技術的發展進步，ALSS 成為治療肝衰竭患者的重要手段，NABL 已經被廣泛應用于臨床，BAL 也在飛速發展并取得了實質性的進步。國內外不同研究在人工肝對于肝衰竭患者生存率的影響方面結果不一致，在解讀這些研究結果時，應該充分考慮到不同研究的納入標準不盡相同，采用的人工肝治療模式也不盡相同等差異性因素，并且評價人工肝效果時除了評估患者生存率，還應評估其對延長患者等待肝移植時間的作用。在應用NBAL治療時，個體化治療是必然趨勢，應根據患者的疾病具體情況選擇恰當的治療時機、合適的治療模式，制訂合理的治療參數，及時評估患者預后，爭取患者獲益最大化。BAL可以補充NABL缺乏的合成、代謝等肝臟功能。國內已有多家研究中心開展了BAL 的研究工作，取得了令人鼓舞的成果，筆者期待BAL進一步的開發和臨床應用，希望在未來能夠使更多肝衰竭患者受益。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：周莉、楊顏榕負責查閱和分析資料，撰寫論文；陳煜負責選題，擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。