基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術結合多元統計分析比較不同品種牛膝藥材化學成分的差異

晏露婷，宋永貴，艾志福，李惠珍，楊 明, ，朱根華，張 琦，邵文祥，袁 恩，蘇 丹*

1.江西中醫藥大學 抑郁癥中醫證候動物模型、中藥藥效（防治精神障礙腦疾?。┰u價江西省中醫藥管理局重點研究室，江西 南昌 330004

2.江西古香今韻大健康產業有限公司，江西 南昌 330004

3.江西中醫藥大學中醫學院，江西 南昌 330004

4.江西中醫藥大學 大型儀器共享服務中心，江西 南昌 330004

《中國藥典》2020 年版收載的牛膝有懷牛膝和川牛膝2 種。懷牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根。川牛膝為莧科川牛膝CyathulaofficinalisK.C.Kuan 的干燥根[1]。然而牛膝的來源復雜、品種多樣，除以上2 種藥典收載的品種外，尚有紅牛膝、土牛膝等混用、誤用作牛膝的情況。紅牛膝是指莧科頭花杯莧CyathulacapitataMoq.的干燥根[2]。成方制劑中最新版藥典未收載的藥材和飲片中規定土牛膝是指莧科植物粗毛牛膝AchyranthesasperaL.的干燥根及根莖。藥典記載懷牛膝逐瘀通經、利尿通淋、補肝腎、強筋骨；川牛膝逐瘀通經、通利關節、利尿通淋[1]?！吨兴幹尽穂3]言懷牛膝更長于補益肝腎，川牛膝更長于祛風利下焦濕。土牛膝則有活血散瘀、清熱解毒、利尿的功效，《本草匯箋》[4]記載其主破血氣。紅牛膝側重于祛風濕，逐瘀血[5]?？梢?，雖然懷牛膝、川牛膝、紅牛膝、土牛膝均為同科植物干燥根，但其在功效及臨床應用上差別很大。但是，目前牛膝藥材在生產上混種、市場上混售的現象仍普遍存在[6-7]，這不僅給臨床用藥帶來了極大的安全隱患，也嚴重阻礙了牛膝藥用資源的合理利用。

不同品種牛膝的功效差異與其所含化學成分的組成密切相關，明晰常用牛膝品種的化學成分將有助于理解其活性差異并促進各品種資源的有效開發與利用。目前，對這4 種牛膝的化學成分研究，主要集中在川牛膝和懷牛膝上，有關土牛膝和紅牛膝成分分析研究匱乏，雖地方習用，但尚無相關質量控制標準。同時，對這些不同品種間的差異物質與化學成分標志物研究也為空白。故本實驗采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用技術首先對牛膝藥材的化學成分進行測定分析，獲得包括土牛膝和紅牛膝在內的不同牛膝品種的物質信息。在此基礎上，結合多元統計分析方法對懷牛膝、川牛膝、紅牛膝、土牛膝進行差異化合物的分析比較。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-30AD 型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；TripleTOF 5600+型高分辨質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；Allegra X-64R 型高速臺式冷凍離心機（德國Beckman 公司）；AE240 型十萬分之一電子天平（美國Mettler-Toledo 公司）；Milli-Q 超純水機（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與材料

4 種不同品種牛膝藥材各有數批次，其中懷牛膝包括河南武陟、焦作各5 批；川牛膝包括四川寶興、天全各5 批，二者均購自于江西江中中藥飲片有限公司。紅牛膝包括江西新建、安義各5 批；土牛膝包括江西新建、江西安義、安徽蕪湖和安徽南陵各5 批，具體信息見表1。紅牛膝、土牛膝由安徽中醫藥高等?？茖W校劉學醫教授采集。以上4 種牛膝藥材經江西中醫藥大學吳蜀瑤主管藥師分別鑒定為莧科植物牛膝A.bidentataBl.、川牛膝C.officinalisK.C.Kuan、頭花杯莧C.capitataMoq.、粗毛牛膝A.asperaL.的干燥根及根莖。色譜級甲醇、乙腈（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；質譜級甲酸（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；其余試劑均為分析純。對照品人參皂苷 R0（批號AFCC0151）、楤木皂苷A（批號AF21050702）購自于成都埃法生物科技有限公司；齊墩果酸（批號DST20210602）購自于成都德思特生物技術有限公司；牛膝皂苷D（批號HR235W1）購自于寶雞市辰光生物科技有限公司，各對照品質量分數均大于98%。

表1 4 種牛膝藥材樣品信息Table 1 Sample information of four kinds of A.bidentata medicinal materials

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的配制 精密稱取4 種牛膝干燥樣品各2 g。分別加入10 倍量75%乙醇溶液，80 ℃回流提取2 h，趁熱抽濾，將濾液濃縮至約2 mL 后用75%乙醇溶液分別將其定容于5 mL 量瓶中，超聲混勻30 min，最后將每種樣品取出適量于1.5 mL離心管，放入高速離心機中15 000 r/min 離心10 min，分別取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，置于1.5 mL 液相瓶內，即得供試品溶液，備用。

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取齊墩果酸、牛膝皂苷D、楤木皂苷A、人參皂苷R0適量，分別用甲醇溶解并配制成0.2 mg/mL 的溶液，取出適量溶液過0.22 μm 微孔濾膜，置于1.5 mL 液相瓶內，即得對照品溶液，備用。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～15 min，5%～40% B；15～63 min，40%～95% B；63～65 min，95%B；65～65.1 min，95%～5% B；65.1～70 min，5% B。柱溫40 ℃，進樣量2 μL，體積流量0.3 mL/min。

2.2.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），正、負離子掃描模式（用亮氨酸腦啡肽作校正液進行實時校正，以確保試驗結果中分子量的精確度和重現性），質量掃描范圍m/z100～1 500，噴霧電壓（ISVE）+5 500/?5 500 V，離子源溫度（TEM）500 ℃，去簇電壓（DP）100 V，碰撞能量（CE）45 V，碰撞能量疊加（CES）15 V，氣簾氣壓力（CUR）275.8 kPa，霧化氣（GS1）和輔助氣（GS2）壓力均為344.8 kPa，數據采集時間70 min，采用 TOF-MS-IDAMS/MS 方式采集數據。IDA 設置響應值超過100 cps 的8 個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍m/z50～1 250。滿足該條件的優先進行二級掃描，開啟動態背景扣除（DBS）。

2.3 數據處理

利用PeakView 1.2 軟件中的Xic Manager、Formula Finder 等功能進行分析計算，根據主成分裂解規律、對照品、相關文獻和各色譜峰二級碎片離子，鑒定各牛膝品種的主要化學成分。

對所得質譜數據經MarkerView 1.2.1 處理，使用 SIMCA 14.1 進行主成分分析（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLSDA），得到變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值＞1 的化合物信息，綜合篩選不同品種懷牛膝、川牛膝、紅牛膝、土牛膝的化學成分差異化合物。

2.4 不同品種牛膝總離子流圖比較

如圖1、2 所示，在正、負離子模式下，牛膝各組樣品的總離子流圖分離度好、響應值較高。研究表明，各組樣品的相似度較高、重合度較小，說明不同品種懷牛膝、川牛膝、紅牛膝、土牛膝的主要化學成分種類及含量不一致。

圖1 UPLC-Q-TOF-MS 正離子模式總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of UPLC-Q-TOF-MS positive ion mode

圖2 UPLC-Q-TOF-MS 負離子模式總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of UPLC-Q-TOF-MS negative ion mode

2.5 4 種常見牛膝所含成分的系統分析

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術按照保留時間的先后順序采集不同品種牛膝的化學成分的相關質譜數據，對樣品溶液進行分析，得到各個樣品總離子流圖，見圖1、2。利用Analyst1.6 色譜工作站中得到的精確相對分子質量及化合物二級碎片信息，使用PeakView1.2 軟件與已建立的牛膝主要成分質譜庫及對照品和相關文獻信息比對，根據各化合物一級質譜、二級質譜信息推測其可能的裂解過程，且質量誤差絕對值均小于5×10?6，正離子模式下的加和物為＋H、負離子模式下的加和物為?H和＋HCOO，在正、負離子掃描模式下尋找牛膝所含的化學成分。最終從該4 種常見牛膝中共鑒定出230 種化學成分，包括牛膝皂苷類成分81 種、甾酮類成分12 種、生物堿類成分26 種、有機酸類成分75 種、木脂素類成分19 種和黃酮類成分17 種，具體信息見表2。

表2 不同品種牛膝中化合物的UPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定結果Table 2 UPLC-Q-TOF-MS/MS identification results of compounds in different varieties of A.bidentata

2.5.1 牛膝皂苷類化學成分鑒定 皂苷類化學成分是牛膝中的主要活性物質，具有抗腫瘤、抗炎鎮痛及免疫調節的作用。在負離子模式下，已從4 種常見牛膝中鑒定或初步表征出牛膝皂苷類成分81種，這些化合物提供了強烈的去質子化離子[MH]?和加合離子 [M＋HCOO]?。牛膝中主要含有齊墩果烷型三萜皂苷，它的裂解模式是皂苷母核的C3或 C28位點糖苷單元的連續丟失，直到形成[oleanolic acid－H]?特征碎片離子。糖苷鍵的丟失一般傾向于優先丟失C28位上的糖基，這可能是由于C28位的酯鍵比C3位的醚鍵更易斷裂。當五碳糖和六碳糖同時存在時，五碳糖優先丟失[8]。從質譜數據中觀察到糖基的種類和數量，其中176、162、146、132 的質量數差異分別表明存在葡萄糖醛酸（GluA）、葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）和木糖（Xyl）或阿拉伯糖（Ara）[9]?，F就牛膝皂苷裂解規律，以achyranthoside D 為例：在負離子采集模式下，二級質譜圖出現了齊墩果酸母核的特征碎片離子m/z455.352 1，并且在低能量下給出 [M－H]?為m/z1 117.509 7，其在高能量下主要的特征碎片離子為955.485 6 [M－C5H7O6－H]?、793.434 6 [MC5H7O6－Glc－H]?、731.436 2 [M－C5H7O6－Glc－H2O－CO2－H]?、631.063 5 [M－C5H7O6－2Glc－H]?、455.352 1 [M－GluA－C5H7O6－2Glc－H]?、161.010 4，通過與對照品及文獻報道[8]比對，推測其為achyranthoside D，分子式為C53H82O25，其二級質譜圖與具體的裂解方式見圖3，其他對照品齊墩果酸、楤木皂苷A 及人參皂苷R0的二級質譜圖見圖4。

圖3 Achyranthoside D 的二級質譜圖及裂解規律圖Fig.3 MS2 spectrum and proposed fragmentation of achyranthoside D

圖4 對照品齊墩果酸 (A)、楤木皂苷A (B) 和人參皂苷R0 (C) 二級質譜圖Fig.4 MS2 spectrum of reference substances, including oleanolic acid (A), araloside A (B) and ginsenoside R0 (C)

2.5.2 牛膝甾酮類化學成分鑒定 甾酮類化合物是牛膝中主要的化合物之一，它的主要結構特征是甾體母核的C6酮基、C7雙鍵、C17上連有一個由8-10 個碳原子所組成的含氧功能基側鏈，母核上A/B環為順勢稠合，B/C 環為反式、C/D 環大多是反式。在負離子模式下，該類化合物的MS 譜圖有3 個系列峰[10]：（1）[M－nH2O－H]?峰；（2）C17-C20開裂之后的片段峰；（3）C20-C22斷裂后的碎片峰。以achyranthesterone A 為例，其在負離子模式下，產生495.295 7 [M－H]?，依次出現脫去1 分子H2O 后的477.286 0 [M－H2O－H]?峰和脫去1 分子H2O 和1分子CO2后的433.274 9 [M－H2O－CO2－H]?峰，并產生m/z319.191 1、301.145 1、159.042 3 的特征性二級碎片離子，結合相關文獻報道[11]，推測其為achyranthesterone A。

2.5.3 牛膝生物堿類化學成分鑒定 根據文獻報道[12]，芐基四氫異喹啉類化合物的分子離子通常會丟失C2H7N或NH3產生 [M－C2H7N]+或 [M－NH3＋H]+的特征子離子。以去甲烏藥堿為例，在正離子模式下，產生272.128 2 [M＋H]+峰，并且出現237.094 7 [MNH3－H2O＋H]+、209.098 0 [M－NH3－H2O－CO＋H]+、161.060 4、143.049 7、107.051 1 等特征碎片離子，結合相關文獻報道[13]，推測其為去甲烏藥堿。

2.5.4 牛膝有機酸類化學成分鑒定 有機酸類化合物是一種廣泛存在于自然界中的酸性有機化合物，具有很強的抗氧化和抗菌、消炎等藥理作用，其在高能量碰撞下通常容易丟失CO、CO2、-COOH、H2O等而產生碎片離子峰[14]。本研究采用正、負離子掃描模式，共指認出有機酸類成分75 個，在MS 掃描過程中以 [M－H]?、[M＋H]+的準分子離子形式存在。以亞油酸為例，在負離子模式下，產生279.234 2[M－H]?峰，出現261.225 3 [M－H2O－H]?等特征碎片離子，結合相關文獻報道[15]，推測其為亞油酸。

2.5.5 牛膝黃酮類化學成分鑒定 在質譜正負離子模式下，黃酮苷類化合物主要的裂解途徑表現在糖基部分的裂解和苷元的特征裂解，黃酮苷元的主要MS 裂解方式是RDA 裂解途徑和小分子或自由基CH3、CO、CO2的丟失。對于黃酮苷，糖苷鍵上的裂解可能以正離子和負離子模式產生，其中162（Glc）、146（Rha）、308（蕓香苷）是黃酮類-O-糖苷的特征性中性碎片離子，具有低質荷比的碎片離子與其糖苷配基的碎片離子相同[16]。山柰素在負離子模式下產生m/z為299.057 6 [M－H]?的準分子離子峰，在m/z284.033 4 處脫去1 個甲基產生 [M－CH3－H]?的子離子峰，經RDA 裂解產生m/z151.002 3 特征碎片。4′-羥基-5,6,7-三甲氧基黃酮，在負離子模式下，依次產生327.088 5 [M－H]?、296.076 5 [M－OCH3－H]?、265.052 1 [M－2OCH3－H]?、234.036 4 [M－3OCH3－H]?等特征碎片峰，提示脫去3 個甲氧基，結合相關文獻報道[17]，推測其為4′-羥基-5,6,7-三甲氧基黃酮。

2.5.6 牛膝木酯素類化學成分鑒定 在ESI+模式下鑒定出19 種木酯素類化合物，且多為雙環氧類木酯素。以表丁香脂素為例并結合自建數據庫及文獻報道闡述牛膝木酯素類化合物的裂解規律和結構鑒定的解析過程?；衔锉矶∠阒卦谡x子模式下，產生m/z419.170 1 [M＋H]+準分子離子峰，并進一步裂解產生m/z383.147 2 [M－2H2O＋H]+、265.089 0、249.057 9 等特征碎片離子，經與文獻信息[18]比對，推測其為表丁香脂素。

2.6 UPLC-Q-TOF-MS/MS 數據分析

2.6.1 PCA 圖1、2 初步分析，不同品種懷牛膝、川牛膝、紅牛膝、土牛膝的化學成分存在顯著差異，為明確其差異性成分，將MS 原始數據導入Marker View 1.2.1 軟件進行去除同位素離子峰、峰提取等處理，將所得數據集矩陣導入于SIMCA 14.1 軟件中進行無監督PCA，得到PCA 得分圖和Loading 散點圖，見圖5。模型驗證結果（R2X＝0.819，Q2＝0.570，P＜0.05），說明模型擬合能力較好，預測能力良好，具有統計學意義。t[1]軸、t[2]軸將以上4 種牛膝分于3 個象限，即懷牛膝、江西土牛膝為一類，川牛膝和紅牛膝為一類，安徽土牛膝為一類，組間差異明顯。我國最早的藥學著作《神農本草經》將懷牛膝列為上品，而目前懷牛膝這種稀有且被廣泛開發的藥用植物面臨著瀕危的問題[19]。加之市場上懷牛膝混售、摻偽現象更為嚴重，且其市場價格更高，故在后續實驗中，以懷牛膝為控制列進行不同品種間的多重比較進而找出差異化合物，為懷牛膝藥材的質控指標提供科學依據。

圖5 不同產地、不同品種牛膝的PCA 得分圖 (A) 和Loading 散點圖 (B)Fig.5 PCA score scatter plot (A) and loading scatter plot (B) of A.bidentata from different origins and varieties

2.6.2 PLS-DA PLS-DA 模型在為樣品組間差異提供最相關變量方面可靠性更強，能夠把與預先設定的和分類無關的信息最大程度從原始矩陣分離，從而將最相關的因素集中到第一個主成分上，進而尋找該主成分的正交矯正軸方向，從而使得組間樣本分離效果更佳，使組內差異弱化，組間差異最大化凸顯，且更適用于多組樣本間的分離。故本實驗在PCA 分析基礎上進行有監督的PLS-DA 分析，找出樣品組間差異化合物。將MS 原始數據導入MarkerView 1.2.1 軟件進行t檢驗、在PLS-DA 分析基礎上進行VIP 值＞1 的篩選，結合化合物的保留時間、母離子和特征碎片離子等信息，共鑒定了25個差異明顯的化合物。這25 個化合物在4 種牛膝中的含量存在顯著性差異。各化合物在不同組別中的相對離子強度變化趨勢見圖6。

圖6 4 種牛膝樣品中差異顯著的特征化合物離子強度趨勢圖 (±s, n = 6)Fig.6 Trend chart of ionic strength of characteristic compounds with significant differences in four A.bidentata samples(±s, n = 6)

3 討論

懷牛膝、川牛膝、紅牛膝和土牛膝為莧科植物的4 個品種，它們廣泛分布于中國的大部分地區。懷牛膝是藥典中的莧科牛膝屬植物，主要分布于河南省，廣泛用于補肝腎、強筋骨。但懷牛膝常與同科植物土牛膝、川牛膝及紅牛膝混淆[20]。川牛膝是《中國藥典》收載的莧科杯莧屬植物，主要在四川省種植并用于逐瘀通經，它常與紅牛膝混淆。此外，懷牛膝、川牛膝、紅牛膝和土牛膝從古至今被習稱為“牛膝”。同名中草藥的混淆在臨床實踐和草藥市場上普遍存在可能，這會在安全性和有效性方面造成破壞性后果。另一方面，牛膝是面臨瀕危問題的稀有且被廣泛開發的藥用植物物種之一，找到具有相同植物成分的定性替代品將有助于減少對此類植物自然棲息地的開發負擔，從而產生相似的成分和藥理效益。UPLC-Q-TOF-MS/MS 具有高分辨率、高靈敏度、特異性強、分析速度快等特點，可實現對中藥復雜體系中化學成分的快速分離和鑒定，故本實驗借助超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用技術結合多元統計分析法對懷牛膝、川牛膝、紅牛膝和土牛膝的全成分進行了鑒別分析并找出了相應的差異化合物。

3.1 樣品提取條件的考察

為了更全面地獲取牛膝藥材中所含化合物的信息，本研究在前期分別比較了不同提取溶劑（甲醇、75%乙醇、5%甲醇、5%乙腈）、不同提取時間（0.5、1、2 h）和不同提取方式（超聲提取、回流提?。悠房傠x子流圖出峰情況的影響。與牛膝藥材甲醇提取液相比，發現75%乙醇作為供試品溶液的提取溶劑時效果最優，不僅可以檢測到皂苷、有機酸等極性較大的化學成分，還可以對極性較弱的生物堿有較好的響應。而且，75%乙醇作為提取溶劑時，離子峰強度較高且出峰量最多，所以本實驗選取10 倍量75%乙醇加熱回流提取2 h 作為樣品的提取條件。

3.2 色譜條件的選擇

在優化方法的過程中，本研究分別對流動相種類（0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇）、流動相梯度洗脫比例及進樣量（2、5 μL）等色譜條件進行了篩選。最終發現采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～15 min，5%～40% B；15～63 min，40%～95% B；63～65 min，95% B；65～65.1 min，95%～5% B；65.1～70 min，5% B；柱溫40 ℃，進樣量2 μL，體積流量0.3 mL/min 等色譜條件時色譜峰峰數較多、分離效果最佳、峰形更好、基線更平滑。

3.3 牛膝藥材差異性成分的比較分析

本實驗通過UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術對不同品種牛膝進行了成分分析，共初步鑒定出230 種化學成分，包括牛膝皂苷類成分81 種、甾酮類成分12種、生物堿類成分26 種、有機酸類成分75 種、木脂素類成分19 種和黃酮類成分17 種。但由于自建數據庫的局限性，尚有部分成分沒有鑒定，有待進一步研究。為了獲取牛膝主要成分豐富的離子信息，本實驗采用ESI 離子源正、負離子掃描模式，發現牛膝皂苷、甾酮類成分在負離子模式下峰形較好、分離度較高，而生物堿類成分在正離子模式下分離較好。將所得樣品原始質譜數據結合多元統計分析手段，即主成分分析和偏最小二乘法-判別分析系統分析了4 種常見牛膝的差異化合物信息，一共篩選出25 種差異標志物可用于以上牛膝的品種判別。

從差異性分析結果來看，竹節參皂苷、牛膝皂苷在懷牛膝中的占比最高，現代研究表明，以上成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及免疫調節等藥理活性[21]。而竹節參皂苷IVa 在紅牛膝中占比居多，該成分具有很好的抗氧化、抗糖基化活性，并在體外細胞實驗中發現其具有良好的促胰島素分泌能力，是潛在的糖尿病治療藥物[22]。甾醇、黃酮醇、有機酸和糖苷類成分在川牛膝中的占比最高，以上4 種成分具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗血栓形成、預防心血管疾病等多種藥理作用[23-26]。齊墩果烷型皂苷和酪胺類生物堿類成分則在安徽土牛膝中占比最多，這2 類成分具有抗炎、抗病毒、抗休克、免疫調節、增加血氧飽和度和保護心血管系統等作用[27-28]。

綜上所述，牛膝含有皂苷、甾酮、生物堿、有機酸、黃酮和木酯素等多種化學成分，運用UPLCQ-TOF-MS/MS 結合多元統計分析技術可實現對牛膝藥材化學成分的快速鑒定，比較樣品間的成分差異，既為牛膝的質量控制提供了參考，也對推動牛膝產業發展、保證牛膝臨床用藥穩定性提供了科學依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突