原花青素對大豆分離蛋白凝膠流變特性及抗氧化活性的影響

李婧御 李元鑫 劉冉 孫永旺 郭尚敬 穆洪靜 趙慶奎

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.03.013

引文格式：李婧御，李元鑫，劉冉，等.原花青素對大豆分離蛋白凝膠流變特性及抗氧化活性的影響[J].中國調味品，2024，49（3）：81-86.

LI J Y， LI Y X， LIU R， et al.Effect of oligomeric proanthocyanidins on rheological properties and antioxidant activity of soybean protein isolate gels[J].China Condiment，2024，49（3）：81-86.

摘要：利用植物多酚原花青素（oligomeric proanthocyanidins，OPC）與大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）的相互作用，采用葡萄糖酸內酯誘導結合超聲波處理制備OPC-SPI凝膠，旨在改善SPI凝膠性能。研究不同濃度OPC（0.1%、0.3%、0.5%）對SPI凝膠流變特性和抗氧化活性的影響。結果表明，隨著OPC濃度的增加，包埋率增加，荷載量減小，最大荷載量達到35.575 3 μg/mg。隨著OPC濃度的增加，OPC-SPI凝膠的彈性模量和黏性模量增加，損耗因子隨之降低，對頻率的依賴性降低；但對凝膠的黏度無顯著差異。OPC-SPI對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、2，2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基以及羥自由基的清除能力優于SPI。OPC能夠有效增強SPI的凝膠黏彈性和抗氧化活性，為進一步開發新型抗氧化復合SPI凝膠提供了理論依據。

關鍵詞：原花青素；大豆分離蛋白；流變特性；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.1????? 文獻標志碼：A????? 文章編號：1000-9973（2024）03-0081-06

Effect of Oligomeric Proanthocyanidins on Rheological Properties

and Antioxidant Activity of Soybean Protein Isolate Gels

LI Jing-yu1， LI Yuan-xin1， LIU Ran1*， SUN Yong-wang1，

GUO Shang-jing1， MU Hong-jing2， ZHAO Qing-kui2

（1.School of Agricultural Science and? Engineering， Liaocheng University， Liaocheng 252000，

China; 2.Shandong Guohong Biotechnology Co.， Ltd.， Liaocheng 252000， China）

Abstract： The OPC-SPI gels are prepared using the interaction of oligomeric proanthocyanidins （OPC） and soybean protein isolate （SPI） by gluconolactone induction combined with ultrasonic treatment， in order to improve the properties of SPI gels. The effects of different concentrations of OPC （0.1%， 0.3%， 0.5%） on the rheological properties and antioxidant activity of SPI gels are investigated. The results show that the encapsulation rate increases and the load decreases with the increase of OPC concentration， reaching a maximum load of 35.575 3 μg/mg. With the increase of OPC concentration， the elastic modulus and viscous modulus of OPC-SPI gels increase， the loss factor decreases， and the dependence on frequency decreases. However， there is no significant difference in the viscosity of gels. The scavenging capacity of OPC-SPI on 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） free radicals， 2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate） （ABTS） free radicals and hydroxyl free radicals is better than that of SPI. OPC can effectively enhance the

gel viscoelasticity and antioxidant activity of SPI， which has provided a theoretical basis for the further development of new antioxidant composite SPI gels.

Key words：oligomeric proanthocyanidins（OPC）;soybean protein isolate（SPI）;rheological properties; antioxidant activity

收稿日期：2023-08-16

基金項目：博士啟動基金項目（318051603）；山東省農業科技園區產業提升工程項目（2019YQ035）；國家自然科學基金青年基金項目（32101788）; 聊城大學博士科研啟動基金項目（318052021）

作者簡介：李婧御（2000—），女，碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種。

*通信作者：劉冉（1989—），女，講師，博士，研究方向：食品化學與營養。

原花青素（oligomeric proanthocyanidins，OPC） 是一種純天然的自由基抗氧化劑，具有良好的抗氧化能力[1]; 組成成分為不同的兒茶素或表兒茶素。OPC含有大量的酚羥基，可以清除自由基，并以鄰苯二酚基團螯合金屬離子，因此比維生素 C、維生素 E有更好的防護作用，防止氧化應激損傷[2]。OPC能發揮抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病、抗癌等藥理作用[3]，因此被廣泛應用于食品中。但OPC易受溫度、光照的影響，穩定性較差[4]，加工過程和貯藏過程中以及在嚴重的胃腸道環境中難以維持活性[5]。目前有多種增強其穩定性的方式。Sheng等[6]利用海藻酸鈉和不同纖維素衍生物對葡萄籽原花青素提取物進行包埋，被包埋的原花青素降解較少。Huang等[7]通過制備京尼平交聯的堿性可溶性多糖-乳清蛋白復合物（G-AWC），以穩定的W/O/W乳狀液對葡萄籽原花青素進行包埋和傳遞，增強了葡萄籽原花青素的穩定性和生物可及性。

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI） 作為大豆油工業加工過程中的副產品，因其含有豐富的氨基酸、營養價值高、功能特性理想和價格低廉而在食品工業中得到廣泛應用[8]。SPI作為一種優質的植物蛋白資源，其應用與其營養特性和功能特性密切相關[9]。凝膠性是SPI的重要性能之一，依賴蛋白質分子聚集成三維網狀結構，具有較高的黏度、可塑性和彈性[10]。但是SPI凝膠的形成具有需要高溫變性、凝膠濃度高、凝膠強度低等缺點[11]。如果將蛋白質和多酚類物質混合使用，不僅可以展示每種食品分子成分的特性優勢，而且可以克服使用單一食品分子基礎材料時的缺點，如成本高和品質差；利用多酚的特點，與蛋白質結合形成多酚-蛋白質復合物，可以增強兩者的功能和生物利用度。比如，將熱改性的β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）與表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）結合，形成穩定的共組裝納米顆粒（Eβ-NPs）。Eβ-NPs抑制了人類惡性黑色素瘤細胞A375和人類食道癌細胞TE-1的增殖，其活性分別比EGCG高69.0%和63.7%[12]?，F階段，SPI成為構建蛋白和多酚復合凝膠的重要組分。Ao等[13]根據虛擬挑選和試驗研究表征了大豆蛋白分離物與食品多酚的相互作用，發現氫鍵和疏水相參與大豆蛋白-多酚結合的主導相互作用。在Han等[14]的研究中，SPI的功能特性和兒茶素（catechin，C）的穩定性可以通過兩者之間的共價相互作用得到改善。目前，關于OPC與SPI相互作用以改善凝膠和功能特性的研究較少。

因而，本研究以OPC和SPI復合體系為研究對象，探究了OPC的添加對SPI復合凝膠體系流變特性和抗氧化能力的影響。通過剪切速率掃描實驗和頻率掃描實驗分析OPC對SPI凝膠流變性能的影響；通過體外自由基清除實驗分析OPC對SPI凝膠抗氧化性的影響，以達到制備一種具有抗氧化性能的SPI凝膠制品的目的。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

SPI：山東國宏生物科技有限公司；葡萄糖酸內酯（國產分析純）；原花青素（葡萄籽提取物）：山東金勝生物科技有限公司；乙醇（無水乙醇）；鹽酸（國產分析純）；香草醛（國產分析純）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）試劑：成都艾科達化學試劑有限公司；FeSO4溶液、H2O2：析標生物科技（福建?。┯邢薰?；水楊酸（國產分析純）；2，2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）試劑：山東西亞化學有限公司；黃原膠：鄂爾多斯市中軒生化股份有限公司；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）：合肥博美生物科技有限責任公司；過硫酸鉀（K2S2O8 ）：廈門海標科技有限公司。

1.2? 試驗儀器

JY92-ⅡN超聲波細胞粉碎機? 南京舜瑪儀器設備有限公司；ZNCL-BS智能加熱磁力攪拌器（140 mm×140 mm）? 上海越眾儀器設備有限公司；SB-2000 水浴鍋? 北京市長風儀器儀表公司；電子天平? 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；UV-2700 紫外可見分光光度計? 上海美析儀器有限公司；DHR-1旋轉流變儀? 美國 TA公司。

1.3? 試驗方法

1.3.1? OPC-SPI分散液的制備

準確稱取OPC 0.05，0.15，0.25 g和SPI 5 g，溶解于蒸餾水中，磁力攪拌均勻，并放置在4 ℃冰箱中充分水化。使SPI的最終濃度為10%，OPC分別設置不同濃度0.1%、0.3%、0.5%，以不添加OPC組為空白對照。

1.3.2? OPC-SPI復合凝膠的制備

參考劉冉等[15]的方法，將上述制備的OPC-SPI溶液在600 W功率下超聲處理，單次超聲工作時間4 s，工作間歇2 s，超聲總工作時間持續10 min。超聲完成后，撇除凝膠表面的氣泡。加入葡萄糖酸內酯，使其濃度達到0.1%，用玻璃棒攪拌均勻后于室溫下放置1～2? h后，封好保鮮膜放入冰箱中，24? h即可成膠。

1.3.3? OPC標準曲線的測定

參考梅瀚等[16]的實驗方法，精確配制1 mg/mL的OPC標準品溶液，并稀釋成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL，取1 mL標準品溶液于試管中與5 mL香草醛-鹽酸顯色劑反應30 min，測定在500 nm最大吸收波長處的吸光度，根據其與濃度的關系得到標準曲線y=0.65x+0.413（R2=0.994 2）。

1.3.4? SPI凝膠包埋OPC的包埋率及荷載量的測定

用無水乙醇沖洗包埋OPC的SPI凝膠表面，將沖洗掉的液體稀釋并定容至100 mL，取1 mL標準品溶液于試管中，與5 mL香草醛-鹽酸顯色劑反應30 min，測定在500 nm波長處的吸光度，將吸光度帶入OPC標準曲線計算OPC濃度并根據公式（1）、（2）計算OPC的包埋率和荷載量。

包埋率（%）=（1-mM）×100%。（1）

荷載量（μg/mg）=M-mW。（2）

式中：m為洗脫液中OPC的含量，g；M為凝膠中OPC的總量，g；W為SPI的含量，g。

1.3.5? 流變特性試驗

將試樣放置在直徑為40 mm的流變儀平板上，并將平板間隔設定為1.0 mm。用刮板從平板上取下多余的試樣，并在其表面涂硅油避免水分揮發。檢測前，將試樣均衡5 min，清除試樣中增加的剩余應力，并保證溫度穩定。流變性測試報告包含應變掃描、頻率掃描、剪切速率掃描，所有樣品測試3次，其中應變掃描是為了確定樣品的線性黏彈區。

1.3.5.1? 頻率掃描試驗

頻率掃描主要參數：應變2%（線性黏彈性區域內），溫度25 ℃，頻率 0.1～10 Hz。精確測量彈性模量（elastic modulus，G′）、黏性模量（viscous modulus，G″）和損耗因子（tanδ）隨頻率變化的變化。G′、G″和角頻率變化的趨勢可以采用 Power-Law流變模型進行擬合[17]。

冪律方程：G′=K′·ωn′；G″=K″·ωn″。（3）

式中：K′和 K″表示冪律常數；n′和n″表示頻率指數，可以用來表示模量對頻率的依賴程度；ω表示角頻率，rad/s。

1.3.5.2? 剪切速率掃描試驗

選用直徑 40 mm 的平板夾具，溫度設置為 25 ℃，應變設置為 0.2%，剪切速率測定范圍設置為 0.1～100 s-1。測定在不同OPC濃度下樣品黏度的變化情況。

1.3.6? DPPH自由基清除能力試驗

配制0.2 mmol/L的DPPH 標準溶液：取3種不同濃度的OPC-SPI 復合凝膠和SPI 凝膠各 0.2 g，分別取3次，即每種濃度做3組平行對照，向各樣品中分別加入 5 mL 0.2 mmol/L 的 DPPH 溶液，避光處理 30 min 后測定在517 nm波長處的吸光度。再取3種不同濃度的OPC溶液（稀釋5 倍）各0.2 mL，分別取3次，即每種濃度做3組平行對照，向各樣品中分別加入 5 mL 0.2 mmol/L的DPPH 溶液，避光處理30 min 后測定在 517 nm波長處的吸光度。將Trolox 配成 1，2，4，6，8，10 mmol/L的濃度，取0.2 g加入 5 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，30 min后在517 nm波長處測定其吸光度。

1.3.7? ABTS自由基清除能力試驗

配制0.2 mmol/L的ABTS儲備液：取3種不同濃度的OPC-SPI復合凝膠和SPI凝膠各0.03 g，分別取3次，即每種濃度做3組平行對照，向各樣品中加入 5 mL ABTS儲備液，測定在734 nm 波長處的吸光度。再取3種不同濃度的OPC-SPI分散液（稀釋5 倍）和SPI 溶液各0.03 mL，分別取3次，即每種濃度做3組平行對照，向試管中分別加入 5 mL 0.2 mmol/L 的ABTS 溶液，測定在 734 nm 波長處的吸光度。將Trolox 配成 1，2，4，6，8，10 mmol/L的濃度，取0.1 g加入ABTS溶液，6 min后在734 nm波長處測定其吸光度。

1.3.8? 羥自由基清除能力試驗

參考顏軍等[18]的方法，取3種不同濃度的OPC-SPI復合凝膠和SPI凝膠各0.03 g，分別取3次，即每種濃度做3組平行對照，向各樣品中加入1.8 mmol/mL FeSO4溶液2 mL，18 mmol/mL水楊酸-乙醇溶液1.5 mL，最后加入H2O2（0.03%） 0.1 mL啟動反應，37 ℃保溫5 min， 測定510 nm 波長處的吸光度。再取3種不同濃度的OPC-SPI 分散液（稀釋5 倍）和SPI 溶液各0.03 mL，分別取3次，即每種濃度做3組平行對照；將Trolox 配成 1，2，4，6，8，10 mmol/L 的濃度，測定方法同上。

1.4? 數據處理

全部試驗反復 3 次，結果以平均值±標準偏差表示，利用OriginPro 2021軟件作圖和Minitab 17.0 軟件進行單因素方差分析（ANOVA）。

2? 結果與分析

2.1? 大豆分離蛋白對原花青素的包埋率及荷載量

由表1可知，SPI凝膠對OPC的包埋率高達92.87%，具有很好的包埋效果，隨著OPC濃度的增大，OPC在凝膠中的荷載量雖然增加，但包埋率下降。OPC在凝膠中一部分以游離的狀態包埋在凝膠的網絡結構中；一部分OPC與SPI通過非共價作用（疏水作用和離子鍵）進行結合轉變成OPC-SPI復合物的形態。

2.2? 原花青素對大豆分離蛋白凝膠黏彈性的影響

SPI凝膠是典型的生物大分子蛋白凝膠，利用流變儀可以對其凝膠彈性進行檢測。彈性模量（elastic modulus，G′）和黏性模量（viscous modulus，G″）是表征流變性能的兩個重要指標，G′是體現物質彈性特征的物理量，G″是體現物質黏性特征的物理量[19]；G″/G′稱為損耗因子，用tanδ表示，tanδ越大，凝膠的流動性越強；tanδ越小，凝膠的固體性能越強[20]。頻率掃描可以反映凝膠的黏彈性。由圖1可知，SPI和OPC-SPI的G′均大于G″，表明SPI和OPC-SPI都表現出彈性模量大于黏性模量的流變學特征。且隨著OPC濃度的增大，模量（G′和G″）增大，tanδ減小，說明OPC提高了SPI的黏彈性。對頻率掃描結果通過冪律函數模型進行擬合，見表2。G′和G″作為頻率的函數均服從冪律模型，K為稠度系數，隨著OPC濃度的增大，K′和K″均增大，說明OPC改善了SPI凝膠的黏彈性；n反映凝膠的頻率依賴性，n′和n″均減小，表明OPC的加入降低了SPI凝膠的頻率依賴性；n′和n″均小于1，證實了SPI和OPC-SPI為非牛頓假塑性流體。

Zhou等[20]利用茶多酚修飾的雞蛋清在改善魚糜凝膠的實驗中發現G′總是高于G″，TP的加入使EW的G′和G″不斷提高并且降低了tanδ的值，表明了凝膠網絡的典型黏彈性固體樣行為，TP的加入形成了更強的凝膠，這與本研究的結果一致，OPC通過相互作用促進了SPI蛋白的相互聚集，從而提高了黏彈性。李立敏等[21]研究表明，添加適量的茶多酚能顯著改善羊肉肌原纖維蛋白的凝膠性能，凝膠的微觀結構致密、間隙小、形狀規則、分布均勻。

2.3? 原花青素對大豆分離蛋白凝膠黏度的影響

由圖2可知，對不同剪切速率下SPI和各濃度OPC-SPI復合凝膠的黏度進行掃描，隨著剪切速率的增大，SPI和OPC-SPI均表現出剪切變稀的現象，即隨著剪切速率的增大，SPI和OPC-SPI復合凝膠的黏度減小，呈現出典型的非牛頓流體的特征。Feng等[22]通過自由基接枝方法合成了卵清蛋白與（+）-兒茶素、（-）-表沒食子素或（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯的共軛物，發現與OVA乳化物相比，用共軛物包覆的魚油乳液表現出的黏度更低，在測試的剪切率范圍內，所有乳劑都表現出顯著的剪切稀化行為，這與本文的研究結論相似，但是本研究發現不同濃度的復合凝膠與SPI之間數值差距較小，說明在測試濃度范圍內OPC對黏度的影響較小。

2.4? 原花青素-大豆分離蛋白復合凝膠抗氧化能力

由圖3可知，與SPI凝膠相比，OPC-SPI凝膠的 DPPH自由基清除能力顯著提高。SPI凝膠的DPPH自由基清除能力為0.082 9，而0.1% OPC-SPI、0.3% OPC-SPI、0.5% OPC-SPI的DPPH自由基清除能力依次為0.420 1，0.640 6，0.823 3。但將相同濃度的OPC-SPI與游離的OPC相比，DPPH自由基清除能力顯著下降。

由圖4可知，與SPI凝膠相比，OPC-SPI凝膠的 ABTS自由基清除能力顯著提高。SPI凝膠的ABTS自由基清除能力為0.014 8，而0.1% OPC-SPI、0.3% OPC-SPI、0.5% OPC-SPI的ABTS自由基清除能力依次為0.161 8，0.272 8，0.579 6。與游離的OPC相比， ABTS自由基清除能力顯著下降。

羥自由基是一種非?；顫姷幕钚匝踝杂苫?，羥自由基減少，可以防止動脈硬化，減少糖尿病的發生率，還可以起到抗衰老的作用。當體系內抗氧化劑存在時，會與水楊酸存在競爭關系，進而影響反應物的吸光度。由圖5可知，與SPI凝膠相比，OPC-SPI凝膠的羥自由基清除能力顯著提高。SPI凝膠的羥自由基清除能力為0.152 1，而0.1% OPC-SPI、0.3% OPC-SPI、0.5% OPC-SPI的羥自由基清除能力依次為0.222 2，0.378 3，0.592 1。與游離的OPC相比，羥自由基清除能力顯著下降。

因此可以看出OPC-SPI凝膠的抗氧化活性顯著優于SPI凝膠，隨著OPC濃度的增大，抗氧化活性逐漸增強，這是由OPC增加引起的。OPC-SPI凝膠與游離的OPC相比，抗氧化活性減弱的原因可能是由兩方面引起的：一方面，OPC被包裹在SPI凝膠網狀結構內部使得OPC無法釋放；另一方面，OPC和SPI之間的相互作用使SPI對自由基的清除具有一定的遮蔽作用。Medina等[23]在研究天然酚類化合物對含鐵脂質和水包油乳液中乳鐵蛋白抗氧化和促氧化活性的影響時發現EGCG等茶多酚與乳鐵蛋白的相互作用可使游離的EGCG在反應系統中的含量下降，從而使其抗氧化能力下降，此研究也證明了這一觀點。

3? 結論

天然來源的抗氧化劑在食品工業中很受歡迎，其可以抑制氧化降解反應；OPC 是一類具有抗氧化活性的多酚類化合物，廣泛應用于食品、藥品等行業。本研究通過葡萄糖酸內酯誘導，在 SPI 中添加 OPC，研究其對 SPI 的流變性及抗氧化性的影響。結果表明，OPC-SPI 復合凝膠是一種存在剪切導致變稀特性的非牛頓流體。OPC可以提高 SPI 的黏彈性，降低G′和G″的頻率依賴性。通過DPPH、ABTS、羥自由基清除試驗評價OPC-SPI的抗氧化活性，隨著OPC濃度的增大，OPC-SPI的自由基清除能力增強，說明OPC的加入提高了 SPI 的抗氧化能力。多酚和蛋白質均是食物中兩種既具有良好結構功能又具有營養功能的物質。因此，兩者是建造具有預期甚至獨特紋理的食物凝膠的良好起始材料。本研究結果有助于開發更優質或獨特的多酚和蛋白質復合凝膠產品。未來，需要進一步研究OPC和SPI的相互作用，開展深層次三元復合凝膠的相關研究，以期使其成為食品中更好的功能成分。

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