潰結康調控PERK-elF2α-ATF4-CHOP信號通路干預內質網應激治療潰瘍性結腸炎的機制研究

李小絲 馬建國 徐榮漪 祁燕

【摘 要】 目的：探討潰結康（KJK）調控PERK-elF2α-ATF4-CHOP通路改善潰瘍性結腸炎（UC）的作用機制。方法：C57BL/6小鼠分為空白組、模型組、陽性對照組、KJK（6.4 g/kg、12.8 g/kg）組，制備DSS誘導的UC小鼠模型，造模同時給予對應藥物治療7 d后處死小鼠，測量結腸長度；HE染色觀察結腸病理損傷；western blot法檢測PERK-elF2α-ATF4-CHOP信號通路蛋白表達。結果：與空白組比較，模型組小鼠DAI評分、Geboes評分明顯升高（P＜0.001）；結腸長度明顯縮短（P＜0.01）；結腸組織中GRP78、CHOP、ATF4、p-PERK、p-elF2α蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，KJK 6.4 g /kg及12.8 g/kg組小鼠DAI評分及Geboes評分明顯降低，結腸長度明顯縮短（P<0.05，P＜0.01）；結腸組織中GRP78、CHOP、ATF4、p-PERK蛋白表達明顯降低（P<0.05，P＜0.01）。結論：KJK可抑制PERK-elF2α-ATF4-CHOP通路信號轉導，改善UC小鼠癥狀。

【關鍵詞】 潰瘍性結腸炎；內質網應激；潰結康；PERK-elF2α-ATF4-CHOP信號通路

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2024）02-0008-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.02.zgmzmjyyzz202402003

Mechanisms of Kuijie Kang Decoction Regulating PERK-elF2α-ATF4-CHOP Signaling

Pathway of Endoplasmic Reticulum Stress to Treat Ulcerative Colitis

LI Xiaosi1 MA Jianguo2 XU Rongyi1 Qi Yan1*

1.Central Laboratory of the First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650000，China；

2.Anorectal Branch，the First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650021，China

Abstract：

Objective To investigate the mechanism by which Kuijie Kang （KJK） regulates the PERK-elF2α-ATF4-CHOP pathway to improve ulcerative colitis （UC）.Method C57BL/6 mice were divided into normal，model，positive control，and KJK （6.4 g/kg，12.8 g/kg） groups. A DSS-induced UC mouse model was established，and corresponding drugs were administered for 7 days before sacrificing the mice. Colon length was measured and HE staining was performed to observe colon pathological changes. Western blotting was used to detect the expression of proteins in the PERK-elF2α-ATF4-CHOP signaling pathway. Results Compared with the normal group，the DAI score and Geboes score of the model group mice were significantly increased （P<0.001）;colon length was significantly shortened （P<0.01）;the expression of GRP78，CHOP，ATF4，p-PERK，and p-elF2α proteins in colon tissue was significantly elevated （P<0.01）. Compared with the model group，the DAI score，Geboes score，and colon length of the KJK 6.4 g/kg and 12.8 g/kg groups were significantly reduced （P<0.05，P<0.01）;the expression of GRP78，CHOP，ATF4，and p-PERK proteins in colon tissue was significantly decreased （P<0.05，P<0.01）.Conclusion KJK can inhibit the PERK-elF2α-ATF4-CHOP pathway and improve symptoms of UC in mice.

Keywords：Ulcerative Colitis;Endoplasmic Reticulum Stress;Kuijie Kang;PERK-elF2α-ATF4-CHOP Signaling Pathway

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是臨床中常見的非特異性腸道炎癥性疾病，極易復發及癌變。近年來，UC 的發病率逐年増高［1］。研究［2］發現，結腸炎患者具有更高的結直腸癌（colorectal cancer，CRC）發生率，且風險隨年齡的增長而增加。UC發病率的逐年上升和治療潰瘍性結腸炎的諸多問題使得加強其病因和發病機理的研究，尋求切實有效、副作用小的治療手段成為世界性的難題。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是各種原因引起的錯誤折疊或未折疊蛋白質在內質網腔中聚集導致的穩態失衡。在真核細胞中，ERS可通過未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），促進錯誤折疊或未折疊的蛋白質正確折疊及分泌，暫停早期蛋白質的翻譯合成，以利于細胞生理功能的恢復［3］。過度和延長的ERS反應會通過涉及依賴或不依賴線粒體的凋亡通路最終導致細胞死亡［4］。腸道黏膜上皮細胞（intestinal epithelial cells，IECs）具有發達的內質網結構，當腸黏膜上皮細胞內質網穩態受到體內、外因素破壞時，內質網功能受到影響，即可觸發ERS、UPR及其介導的信號通路，進而激發促炎因子級聯釋放、細胞凋亡途徑及腸黏膜屏障障礙等病理變化，使腸黏膜受損，最終導致UC的發生發展。

潰結康為云南省中醫醫院王華寧主任醫師臨床治療潰瘍性結腸炎經驗方，全方由痛瀉要方化裁而來，具有疏肝健脾、清熱涼血止血之功。目前，課題組已明確其物質基礎，并從調控NLRP3炎性體、氧化應激、自噬、腸道菌群等不同環節對該方的作用機制進行了探討［5-8］。

鑒于內質網應激誘導上皮細胞凋亡進而破壞腸道上皮屏障功能，潰結康對UC病變時腸黏膜損傷具有明顯促進作用，本研究從調控內質網應激角度探討該方作用機制，以進一步豐富疏肝健脾方治療UC的科學內涵。

1 材料和方法

1.1 動物 C57BL/6雌性小鼠50只，體重18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010，質量檢測單位：蘇州西山生物技術有限公司，小鼠飼養于云南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室SPF級動物實驗室，溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h明暗交替，自由攝取滅菌飼料和飲用水，適應性飼養1周開始實驗。

1.2 試劑和藥物 潰結康處方藥材飲片白術、云茯苓、白芍、陳皮、防風等，購自云南省中醫醫院中藥房，藥材加入10 倍體積水，煎煮3次后，合并水煎液，過濾，于旋轉蒸發儀濃縮制備流浸膏凍存于-20 ℃冰箱備用。柳氮磺胺吡啶腸溶片，國藥準字 H31020557，上海新信誼天平藥業有限公司。葡聚糖硫酸鈉（DSS），購自MP公司，貨號：M8667；elF2 alpha（ 貨號：AF6087）、Phospho-elF2 apha（ 貨號：AF3087）、Phospho-PERK（貨號：AF4499）、PERK Antibody（ 貨號：AF4799） ，以上抗體均購自Affinity；ATF4 Polyclonal antibody（貨號：28657-AP）、CHOP GADD153 Polyclonal antibody（貨號：15204-AP） ，GRP78/BIP Polyclonal antibody（貨號：11587-AP），以上抗體均購自proteintech。

1.3 儀器 RM2235切片機、ASP300S脫水機、DM2500正置顯微鏡＋圖文系統（德國 Leica），BIORAD電泳儀、電泳槽，Odyssey CLX紅外熒光掃描成像系統。

1.4 分組、造模及給藥 50只C57BL/6雌性小鼠適應性飼養一周后隨機分為：空白組、模型組，KJK 12.8 g/kg組、KJK 6.4 g/kg組、柳氮磺胺吡啶組（0.45g/kg），每組10只。除空白組外，其余4組參考 Wirtz等［9］ 的方法建立急性UC小鼠模型，造模同時給予蒸餾水或對應藥物灌胃治療，連續7d后脫頸椎處死，分離結腸，測定結腸長度后，選取1 cm中段結腸組織以磷酸鹽緩沖液沖洗，置于4%多聚甲醛中固定，剩余組織置于-80 ℃保存備用。

1.5 指標檢測

1.5.1 疾病活動指數（DAI）評分 每天觀察動物體質量、大便性狀和隱血情況，按照表1進行評分，將各項評分相加，得出每只動物的DAI，以評估疾病活動情況。DAI評分=（體質量下降評分+大便性狀評分+大便隱血情況評分） /3。見表1。

1.5.2 結腸組織病理形態學觀察 取置于4%多聚甲醛中固定的結腸組織經脫水、包埋、切片染色后顯微鏡下觀察結腸病理變化，對各組小鼠進行Geboes評分［10］，評分標準如下：組織發生結構改變計0分，發生慢性炎癥計1分，固有層可見中性粒細胞計2分，上皮層可見中性粒細胞計3分，隱窩結構破壞計4分，發生糜爛或潰瘍計5分。

1.5.3 Western blot方法檢測 UC小鼠結腸組織中GRP78、CHOP、ATF4、p-PERK、p-elF2α蛋白表達 結腸組織加入蛋白裂解液及蛋白酶、磷酸酶抑制劑，勻漿完成離心收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，經變性后上樣并電泳、濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜兩次后孵育一抗并4 ℃過夜，次日，TBST洗膜后，轉移到含有二抗（稀釋比例為1∶5000）的孵育盒中1 h，孵育完成后，TBST洗膜四次，紅外熒光成像掃描系統檢測熒光強度，用Image J軟件對每條條帶進行讀取分析，以目的蛋白與β-actin的密度比值作為目的蛋白的相對含量。

1.5.4 統計學方法 數據采用統計軟件SPSS 26.0行統計結果分析，以（x±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P< 0.05，P<0.01表示兩組差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ?潰結康對UC模型小鼠體重、疾病活動指數評分和結腸長度的影響 與空白組比較，模型組小鼠體重第3天開始下降（P<0.01））；第5天、第7天顯著下降（P<0.001），DAI評分明顯升高（P<0.001），結腸長度明顯縮短（P<0.01）；與模型組比較，KJK 12.8 g/kg、6.4 g/kg組小鼠體重第5天、第7天結腸長度明顯增加（P<0.05）、DAI評分明顯降低（P<0.05）；柳氮磺胺吡啶組小鼠體重第3天、第5天、第7天明顯增加（P<0.01、P<0.05），DAI評分顯著降低（P<0.05），結腸長度明顯增加（P<0.01）。見表2。

2.2 潰結康對UC模型小鼠結腸組織形態及Geboes評分的影響 HE染色結果表明，空白組小鼠結腸組織結構完整，細胞排列整齊，無明顯炎性細胞浸潤。模型組小鼠結腸組織炎細胞浸潤，上皮細胞破壞，黏膜下層充血水腫。KJK組小鼠腺體結構完整度好轉，炎性細胞浸潤程度及結腸黏膜破壞減輕。如圖1所示。Geboes評分結果表明，與空白組比較，模型組Geboes評分顯著升高（P＜0.001）；KJK 12.8 g/kg、6.4 g/kg組和柳氮磺胺吡啶組Geboes評分顯著降低（P＜0.01） 。見表3。

A.空白組；B：模型組；C：KJK 12.8 g/kg組；D：KJK 6.4 g/kg組；E：柳氮磺胺吡啶組

圖1 潰結康對UC模型小鼠結腸組織形態的影響圖

2.3 潰結康對UC模型小鼠結腸組織中GRP78、CHOP、ATF4、p-PERK/PERK、p-elF2α /elF2α蛋白的影響

2.3.1 對內質網應激標記蛋白GRP78、CHOP的影響 與空白組比較，模型組小鼠結腸組織GRP78和CHOP蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，KJK 12.8 g/kg組可顯著下調GRP78和CHOP蛋白表達（P<0.01、P<0.05）；KJK 6.4 g/kg組GRP78和CHOP蛋白表達均降低（P<0.05）；柳氮磺胺吡啶組GRP78和CHOP蛋白表達均下調（P<0.01、P<0.05）。見表4，如圖2所示。

2.3.2 對內質網應激調控蛋白ATF4、p-PERK、p-elF2α表達的影響 與空白組比較，模型組小鼠結腸組織中ATF4、p-PERK/PERK、p-elF2α/elF2α 蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，KJK 12.8 g/kg組ATF4、p-PERK/PERK、p-elF2α/elF2α 蛋白表達顯著降低（P<0.05）；KJK 6.4 g/kg組ATF4、p-PERK/PERK蛋白表達均下降（P<0.05），p-elF2α/elF2α蛋白表達無明顯變化；柳氮磺胺吡啶組ATF4、p-elF2α /elF2α蛋白表達顯著降低（P<0.01），p-PERK/PERK蛋白表達降低（P<0.05）。見表5，如圖3所示。

3 討論

研究［11］表明，腸上皮細胞凋亡、腸黏膜損傷導致腸黏膜屏障穩態破壞是UC發病和復發的重要原因。目前，國際上已將“黏膜愈合”確定為UC的主要治療目標和重要預后評估指標。促進腸上皮黏膜修復，維持腸屏障功能穩態已成為治療UC藥物研發的主要方向。

內質網為鈣離子代謝、蛋白質發揮功能及脂質合成的主要場所。在病理條件下，細胞受到多種外源性應激源刺激，內質網腔內大量未折疊或以錯誤方式折疊的蛋白質積聚或腔內鈣離子失衡誘導的細胞內穩態失衡過程［12］。正常狀態下，ERS標志蛋白-葡萄糖調節蛋白78 （glucose regulated pro- tein78，GRP78） 與內質網膜上的跨膜蛋白PERK、活化轉錄因子 6（activating transcription factor 6，ATF6） 和肌醇酶 1（inositol requiring enzyme l，IREI）結合，疾病狀態下，細胞應激反應發生，GRP78與以上三種結合蛋白解離，并促使結合蛋白活化，而啟動保護性的未折疊蛋白反應［13］。適度的ERS，有助于改善蛋白質的合成和加工過程，從而避免細胞在應激狀態下損傷死亡，但若應激反應過久或過強，未折疊蛋白反應不足以完全代償緩解細胞損傷，活化的跨膜感受蛋白將進一步激活細胞凋亡程序，最終誘發應激細胞程序性死亡［14］。PERK-eIF2α-CHOP通路為與內質網應激相關的重要的凋亡信號轉導途徑。應激狀態下，PERK與GRP78解離后通過同源二聚化而磷酸化激活自身，促使轉錄活化因子4（the activating transcrip- tion factor 4，ATF4）的翻譯和表達，激活ERS特有的凋亡標志蛋白CHOP的基因轉錄。CHOP的表達可調節死亡受體途徑和線粒體途徑，最終激活凋亡效應子Caspase-3，導致細胞凋亡發生。腸上皮細胞內質網結構豐富、發達，且持續暴露并與腸腔內病原微生物接觸，病變時，受炎性介質及缺血缺氧等刺激，內質網應激反應活躍。因此，調控腸上皮細胞ERS反應，進而抑制腸上皮細胞凋亡，保護腸黏膜，并促進其修復為改善UC的一重要途徑。

潰結康組方為白術、云茯苓、白芍、陳皮、防風、桔梗、三七、槐花、地榆、甘草。全方具疏肝健脾，清熱涼血止血之功?，F代藥理學研究［15-18］表明，方中多味藥的藥效成分均具有調控內質網應激作用。本研究結合前期研究基礎及以上文獻報道，以內質網應激為切入點，探討潰結康調控PERK-elF2α-ATF4-CHOP信號通路促進UC小鼠腸黏膜修復的機制。結果顯示，潰結康可逆轉UC小鼠體重降低及結腸長度縮短，改善結腸病理損傷。進一步檢測結腸組織中內質網應激相關蛋白表達，結果顯示，潰結康可顯著下調內質網應激標記蛋白及調控蛋白GRP78、CHOP、ATF4、p-PERK/PERK、p-elF2α/elF2α蛋白表達。表明潰結康對PERK-elF2α-ATF4-CHOP信號通路具有一定的調控作用，提示干預內質網應激相關通路，減輕腸上皮細胞損傷及黏膜屏障破壞為潰結康改善UC的重要機制之一。研究結果進一步豐富了疏肝健脾方治療UC的療效機制的認識。

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（收稿日期：2023-05-05 編輯：劉斌）