LEASO 患者血清miR-21、miR-126水平與HMGB1/TLR4信號通路活性和術后復發的關系

李雪松，劉一東，肖永生，劉喆，張芊慧

天津第四中心醫院血管外科，天津 300140

下肢動脈硬化閉塞癥（LEASO）是動脈粥樣硬化（AS）引起的下肢供血動脈狹窄或閉塞，股腘型是LEASO 最常見類型，嚴重影響患者生活質量［1-2］。血管腔內介入是LEASO 首選治療方法，但術后復發率仍較高［3］。了解股腘型LEASO 介入術后復發的影響因素，對降低術后復發非常重要。研究表明，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll 樣受體4（TLR4）信號通路介導的炎癥反應參與LEASO 發生發展［4-5］。微小核糖核酸（miR）能通過調控炎癥反應參與LEASO 發生發展［6］。miR-21、miR-126 是一種炎癥相關miRNA，能通過調控多種基因表達參與炎癥過程［7-8］。有實驗指出，miR-21 與miR-126 能分別通過影響血管平滑肌細胞功能與血管內皮功能參與LEASO 發生［9-10］。然而關于血清miR-21、miR-126 表達與股腘型LEASO 患者術后復發的關系尚不明確。2020 年1 月—2023 年3 月，我們探討了股腘型LEASO 患者血清miR-21、miR-126 水平與HMGB1/TLR4 信號通路活性和術后復發的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020 年1 月—2021 年3 月在天津市第四中心醫院行介入手術的股腘型LEASO患者120 例，本研究經天津市第四中心醫院倫理委員會批準（編號：K2019-524）。其中男71 例、女49例，年齡41～76（59.84 ± 8.10）歲；泛大西洋協作組織共識Ⅱ（TASCⅡ）分型［11］：A 型23 例、B 型28 例、C型49 例、D 型20 例。納入標準：①年齡>40 歲；②患者或家屬簽署同意書；③符合《下肢動脈硬化閉塞癥診治指南》［12］LEASO 診斷標準，且經影像學檢查為股腘動脈閉塞癥；④首次接受介入手術治療；⑤彩色多普勒超聲或CT血管成像檢查血管狹窄超過50%；⑥介入手術成功。排除標準：①合并下肢骨折；②髂動脈、股動脈LEASO；③妊娠及哺乳期女性；④介入手術禁忌證（如嚴重凝血功能障礙、碘過敏等）；⑤免疫性疾病和惡性腫瘤；⑥精神異常；⑦急性肢體缺血、多發性大動脈炎、血栓閉塞性脈管炎等其他動脈疾病。股腘型LEASO 患者入院后均接受介入手術治療，出院后通過電話、門診等方式隨訪2年，每6個月1 次，隨訪截至2023 年3 月或術后復發。術后復發定義為隨訪期間數字減影血管造影發現支架管腔血管狹窄超過50%［13］。根據術后是否復發將股腘型LEASO患者分為復發組和未復發組。

1.2 血清miR-21、miR-126 和外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達檢測 收集股腘型LEASO患者介入術前1 d空腹外周靜脈血6 mL，保存于兩管試劑管中，其中一管以10 cm半徑，3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存于－80 ℃冰箱中用于血清miR-21、miR-126 檢測；另一管肝素鈉抗凝后，通過密度梯度離心法分離外周血單個核細胞用于外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達檢測。使用TRIzol 總RNA 提取試劑盒（上海冠泰生物科技有限公司）提取血清和外周血單個核細胞中總RNA，紫外分光光度計［島津企業管理（中國）有限公司，型號：UV-3600i Plus］完成RNA 濃度和純度合格鑒定后，使用TaKaRa 反轉錄試劑盒［寶日醫生物技術（北京）有限公司］反轉為互補RNA，反應條件：40 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min。由南京金斯瑞生物科技股份有限公司完成引物設計和合成，將收到的引物用無酶水溶解后，參考實時熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）說明書，取1 μL反轉錄產物為模板，加入10 μL 2×熒光定量聚合酶鏈式反應液、0.5 μL上反向引物、7.5 μL無酶去離子水，混合均勻后置于聚合酶鏈反應系統［賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：ProFlex?］進行反應。反應條件：95 ℃ 5 min 1 次，95 ℃ 30 s、60 ℃30 s、72 ℃ 60 s 40 次。miR-21、miR-126 以U6 為內參校正，HMGB1、TLR4 以GAPDH 為內參校正，采用2-ΔΔCT法計算miR-21、miR-126、HMGB1、TLR4相對表達量。miR-21 正向引物5'-TCGGCAGGU GGUGGGCCGCAG-3'，反向引物5'-CACTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；miR-126 正向引物 5'-TGCAACATCATCTGCTCCCA-3'，反向引物5'-CTGAATAACTGATGGCTGGGC-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3'；HMGB1 正 向 引 物 5'-GAAAGCGCAAGTCTTCAAAG-3'，反向引物5'-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3'；TLR4 正向引物5'-GGACTCTCGCTGGTCTACCT-3'，反向引物5'-GGGCACAATATGCAGGCAGA-3'；GAPDH 正向引物5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，反向引物5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。

1.3 統計學方法 采用SPSS28.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以±s表示，比較采用t檢驗；偏態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組比較行U檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。股腘型LEASO 患者血清miR-21、miR-126 與外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達的相關性采用Pearson相關法進行分析；影響股腘型LEASO患者介入術后復發的因素采用多因素Logistic 回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 復發組與未復發組血清miR-21、miR-126 和外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達比較 隨訪2 年，120 例股腘型LEASO 患者術后復發41 例，復發率為34.17%（41/120）。復發組血清miR-21 和外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達高于未復發組，血清miR-126 表達低于未復發組（P＜0.05）。見表1。

表1 復發組與未復發組血清miR-21、miR-126和外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達比較（± s± s）

表1 復發組與未復發組血清miR-21、miR-126和外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達比較（± s± s）

組別復發組未復發組n 41 79 t P miR-21 1.82 ± 0.35 1.46 ± 0.34 7.216＜0.05 miR-126 0.36 ± 0.07 0.44 ± 0.06-7.051＜0.05 HMGB1 mRNA 1.42 ± 0.18 1.23 ± 0.17 6.478＜0.05 TLR4 mRNA 2.74 ± 0.18 2.53 ± 0.18 6.738＜0.05

2.2 血清miR-21、miR-126 與外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表達的相關性 Pearson相關法分析顯示，股腘型LEASO患者血清miR-21與外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達呈正相關（r分別為0.660、0.649，P均＜0.05），miR-126 與外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達呈負相關（r分別為－0.632、－0.641，P均＜0.05），外周血單個核細胞HMGB1 mRNA 與TLR4 mRNA表達呈正相關（r=0.742，P＜0.05）。

2.3 股腘型LEASO 患者介入術后復發組與未復發組臨床資料比較 兩組性別、年齡、TASCⅡ分型、飲酒、高脂血癥、冠心病、完全閉塞、血管病變長度、術前實驗室指標、支架數量和支架長度比較差異無統計學意義（P均>0.05），復發組吸煙、高血壓、糖尿病和單純球囊擴張比例高于未復發組（P均＜0.05）。見表2。

表2 復發組與未復發組臨床資料比較

2.4 影響股腘型LEASO 患者介入術后復發的多因素Logistic回歸分析結果 高血壓、糖尿病和miR-21、HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 升高為股腘型LEASO患者介入術后復發的獨立危險因素，miR-126 升高為獨立保護因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 影響股腘型LEASO患者介入術后復發的多因素Logistic回歸分析結果

3 討論

血管腔內介入是股腘型LEASO 患者的重要治療手段，能有效重建血運，緩解肢體潰瘍壞疽、靜息痛、間歇性跛行為等癥狀，但仍有部分患者術后動脈再次狹窄甚至閉塞［14］。

HMGB1是一種高度保守核蛋白，能通過與髓樣分化蛋白2 結合激活TLR4 復合物形成HMGB1/TLR4 信號通路，并由此活化核因子-κB（NF-κB），促進大量炎性細胞因子釋放，且HMGB1/TLR4 是AS發生發展的關鍵炎癥信號通路之一［15］。本研究結果顯示，股腘型LEASO 患者外周血單個核細胞HMGB1 mRNA 與TLR4 mRNA 表達呈正相關，提示HMGB1/TLR4 信號通路在股腘型LEASO 患者中處于激活狀態。結果還顯示，復發組外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表達升高，是股腘型LEASO 患者術后復發的獨立危險因素，說明HMGB1/TLR4 信號通路激活參與股腘型LEASO 術后復發。

miR-21 最初于腫瘤細胞中檢測發現，近年研究發現，miR-21 能通過調控免疫細胞或靶基因參與炎癥反應過程，在冠心病、急性腦梗死等AS 相關疾病中發揮重要作用［16-17］。賈敏等［18］研究報道，miR-21表達上調能促進內皮細胞炎癥反應，進而促進載脂蛋白E敲除小鼠AS發生發展。miR-126定位于人染色體9q34.3，由于其特異性表達于血管內皮細胞，并通過抑制炎癥發揮血管內皮保護作用，因此被認為是心血管疾病的保護因子［19］。SHOU 等［20］研究報道，miR-126 在氧化低密度脂蛋白建立的泡沫細胞中低表達，上調miR-126 能抑制泡沫細胞發育和巨噬細胞向促炎表型轉換，進而抑制AS形成。上述研究表明，miR-21、miR-126 可通過炎癥反應參與AS形成。本研究結果顯示，復發組血清miR-21 表達升高，且是股腘型LEASO 患者介入術后復發的獨立危險因素；血清miR-126 表達降低，而其表達升高是股腘型LEASO 患者介入術后復發的獨立保護因素，說明二者與股腘型LEASO 患者介入術后復發密切相關。分析原因可能是miR-21 高表達能通過絲裂原活化蛋白激酶1/2 通路激活炎癥，促進平滑肌細胞表型轉換而導致AS 形成，增加股腘型LEASO 患者介入術后復發風險［9］；miR-126高表達通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 抑制炎癥反應，減輕血管內皮細胞損傷和凋亡，進而降低股腘型LEASO 患者介入術后復發風險［10］。

本研究結果還發現，股腘型LEASO 患者外周血單個核細胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 與血清miR-21表達呈正相關，與miR-126表達呈負相關，提示miR-21 高表達和miR-126 低表達可能通過HMGB1/TLR4 信號通路影響股腘型LEASO 患者術后復發。LIU 等［21］研究顯示，上調miR-126能靶向下調HMGB1 及其反向促炎基因表達，改善缺氧酸中毒誘導的血管內皮細胞炎癥損傷。此外本研究結果還發現，高血壓、糖尿病也會增加股腘型LEASO 患者介入術后復發風險。分析原因可能是持續血壓升高和高血糖會加劇血管壁損傷，激活血管壁炎癥反應導致AS形成，進而導致術后復發風險增加［22］。

綜上所述，血清miR-21 高表達和miR-126 低表達與股腘型LEASO 患者HMGB1/TLR4 信號通路激活有關，且血清miR-21高表達是股腘型LEASO患者術后復發的獨立危險因素，miR-126 低表達是保護因素。