lncR-HOXA-AS3 靶向miR-29a 對前列腺癌細胞凋亡和自噬的影響

李強，劉晶，張國民，王亮，劉志飛，朱研峰

1 開灤總醫院林西醫院泌尿外科，河北唐山 063100；2 唐山市人民醫院泌尿外科

前列腺癌（PCa）是男性尤其是發達國家男性癌癥死亡的主要原因，近年來發病率呈上升趨勢［1］。盡管在過去的幾十年里，藥物治療、放射治療、前列腺根治術和擴大盆腔淋巴結清掃取得巨大成就，但約20%的患者診斷時已為晚期或遠處轉移，這部分PCa患者預后不良的問題目前仍未解決［2-3］。自噬是細胞程序性死亡的途徑之一，自噬在腫瘤的發生發展中發揮多種作用，一方面，適當的自噬可降低細胞內有害物質，維持腫瘤細胞的生存；另一方面，過度自噬可誘導腫瘤細胞凋亡［4］。研究表明，長鏈非編碼RNA（lncR）作為致癌基因或抑癌基因，能調控腫瘤細胞增殖、凋亡及自噬，在多種癌癥的發生、發展和轉移中起重要作用［5］。lncR-HOXA-AS3 是一種位于染色體7p15.2 的新型lncR，是一組高度同源的轉錄因子，主要調節胚胎發育。既往研究報道，在多種腫瘤組織和細胞中觀察到lncR-HOXA-AS3 表達上調，并能促進腫瘤進展和預測患者不良預后［6-8］。但至今，PCa 中lncR-HOXA-AS3 表達及作用機制的研究甚少。近期文獻證實，lncR-HOXA-AS3 可通過靶向調控miR-29a 影響腫瘤細胞的生物學行為［9］。2022 年5 月—12 月，本研究探討lncR-HOXA-AS3 和miR-29a 在PCa 細胞系中的表達變化，并觀察其對PCa細胞凋亡及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人PCa 細胞系LNCaP、C4-2B、DU-145及正常前列腺細胞系RWPE-1均購自中國典型培養物保藏中心。TRIzol試劑購自北京天根生化科技有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物技術發展有限公司；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega 公司；RIPA 裂解液購自江蘇碧云天生物技術有限公司；反轉錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；lncRNA沉默質粒陰性對照si-NC、lncR-HOXA-AS3 沉默質粒si-HOXA-AS3、miRNA 抑制物陰性對照anti-miR-NC、miR-29a 抑制物anti-miR-29a、miRNA模擬物陰性對照mimics-NC、miR-29a模擬物miR-29 mimics、熒光素酶報告基因質粒野生型HOXA-AS3-WT、突變型HOXA-AS3-MUT均購自上海吉瑪制藥技術有限有限公司；抗Caspase-3、抗LC3，抗Beclin1、抗GAPDH 一抗及HRP標記的二抗IgG均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養、轉染及分組 將LNCaP、C4-2B、DU-145 細胞接種至含10%胎牛血清RPMI 1460 培養基，RWPE-1細胞接種至含10%胎牛血清D-KSFM培養基中，均放置于37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養。轉染操作時，取對數生長期LNCaP 細胞接種于6孔細胞板內，應用LipofectamineTM3000按照說明書操作，分別將si-HOXA-AS3、si-NC、si-HOXAAS3+anti-miR-NC、si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 轉染至LNCaP 細胞，轉染后細胞分為si-HOXA-AS3 組、si-NC 組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組、si-HOXAAS3+anti-miR-29a 組，轉染12 h 后，將培養基更換為含10%胎牛血清的RPMI 1460 培養基，繼續置于37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養中培養48 h。

1.3 lncR-HOXA-AS3 和miR-29a 表達檢測 采用RT-qPCR 法。應用TRIzol 法提取DU-145、LNCaP、C4-2B 和RWPE-1 細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 樣品OD260/OD280值1.8～2.0 為合格標準。按照Prime ScriptTMⅡ 1 Strand CDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒反轉錄獲得cDNA，應用RT-qPCR 試劑盒按照說明書加入PCR 引物，進行PCR 擴增反應。lncR-HOXA-AS3 正向引物：5'-AGGAAACATCAGGGCGTACA-3'，反向引物：5'-ATCCTAAGTGCTTGCACCCT-3'；miR-29a 正向引物：5'-TAGCACCATCTGAAATCGGTTA-3'，反向引物：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；內參GAPDH 正向引物：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，反向引物：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。內參U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR反應條件：94 ℃ 15 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃30 s，共40 個循環。lncR-HOXA-AS3 和miR-29a 的相對表達量應用2-ΔΔCt法計算。

1.4 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術測算細胞凋亡率。收集各組LNCaP細胞，PBS液清洗2次，加入預冷結合緩沖液，制備細胞懸液（細胞密度1×106/mL）。取100 μL 細胞懸液置入流式管，避光條件加入5 μL PI 和5 μL Annexin V-FITC，避光繼續孵育15 min，加入預冷的結合緩沖液混勻后，立即用流式細胞儀測算細胞凋亡率。

1.5 Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法檢測蛋白的相對表達量。取各組LNCaP 細胞，RIPA 裂解冰上裂解20 min，離心取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。每泳道加入等量總蛋白進行上樣，10 % SDS-PAGE 電泳分離蛋白，濕轉法轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶里室溫封閉2 h，TBST 洗膜3 次，加入一抗Caspase-3（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）、Beclin1（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）抗體后，室溫孵育，次日洗膜后加入二抗，ECL顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證 取LNCaP 細胞接種于24 孔細胞板，按照LipofectamineTM3000 說明書操作，將HOXA-AS3-WT、HOXA-AS3-MUT，與miR-29 mimics或mimics-NC共轉染至LNCaP細胞，轉染后分別命名為HOXA-AS3-WT+miR-29 mimics 組、HOXA-AS3-WT+mimics-NC 組、HOXA-AS3-MUT+miR-29 mimics 組、HOXA-AS3-MUT+mimics-NC 組。轉染24 h后，細胞裂解液裂解細胞，應用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測各組細胞的相對熒光素酶活性。

1.7 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。計量數據符合正態分布以±s表示，比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCa 中lncR-HOXA-AS3、miR-29a 表達比較RT-qPCR 結果顯示，RWPE-1、DU-145、LNCaP、C4-2B 細胞中lncR-HOXA-AS3的相對表達量分別為1.00 ± 0.04、1.71 ± 0.07、1.92 ± 0.12、1.77 ±0.18；miR-29a 的相對表達量分別為1.05 ± 0.03、0.66 ± 0.08、0.47 ± 0.09、0.63 ± 0.10。與RWPE-1相比，DU-145、LNCaP、C4-2B 細胞系中lncR-HOXAAS3表達均升高（P均＜0.05），miR-29a表達均降低（P均＜0.05）。選取LNCaP細胞進行后續實驗。

2.2 各組熒光素酶活性及LNCaP 細胞miR-29a 相對表達量比較 雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，HOXA-AS3-WT+miR-29 mimics 組、HOXA-AS3-WT+mimics-NC 組、HOXA-AS3-MUT+miR-29 mimics組、HOXA-AS3-MUT+mimics-NC 組LNCaP 細胞相對熒光素酶活性分別為0.48 ± 0.07、0.99 ± 0.04、1.02 ± 0.05、1.04 ± 0.06。HOXA-AS3-WT+miR-29 mimics 組LNCaP 細胞相對熒光素酶活性低于HOXA-AS3-WT+mimics-NC 組（P＜0.05），而HOXAAS3-MUT+miR-29 mimics 組與HOXA-AS3-MUT+mimics-NC 組LNCaP 細胞相對熒光素酶活性比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

si-NC 組、si-HOXA-AS3 組、si-HOXA-AS3+antimiR-NC 組、si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 組miR-29a相對表達量分別為1.05 ± 0.03、3.15 ± 0.32、3.21 ±0.28、1.32 ± 0.21。與si-NC 組相比，si-HOXA-AS3組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組LNCaP 細胞中miR-29a 表達升高（P均＜0.05）；與si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 組相比，si-HOXA-AS3 組、si-HOXAAS3+anti-miR-NC組miR-29a表達升高（P均＜0.05）。提示lncR-HOXA-AS3靶向調控miR-29a表達。

2.3 各組細胞凋亡率比較 si-NC組、si-HOXA-AS3組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組、si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 組細胞凋亡率分別為（5.3 ± 1.4）%、（20.6 ± 3.1）%、（21.3 ± 2.9）%、（7.5 ± 1.8）%。與si-NC 組相比，si-HOXA-AS3 組、si-HOXA-AS3+antimiR-NC 組細胞凋亡率升高（P均＜0.05）；與si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 組相比，si-HOXA-AS3組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組細胞凋亡率升高（P均＜0.05）。提示沉默lncR-HOXA-AS3 可促進LNCaP 細胞凋亡，轉染anti-miR-29a 能逆轉沉默lncR-HOXA-AS3對LNCaP細胞凋亡的促進作用。

2.4 各組Caspase-3、LC3II/LC3I 及Beclin 1 蛋白表達比較 見表1、圖1。與si-NC組相比，si-HOXA-AS3組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組LNCaP 細胞Caspase-3、LC3II/LC3I 及Beclin 1 蛋白表達升高（P均＜0.05）。 與si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 組相比，si-HOXA-AS3 組、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 組LNCaP 細胞Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1 蛋白表達升高（P均＜0.05）。

圖1 Western blotting檢測各組LNCaP細胞凋亡相關蛋白和自噬相關蛋白表達

表1 各組LNCaP 細胞Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對表達量比較（± s）

表1 各組LNCaP 細胞Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對表達量比較（± s）

注：與si-NC組比較，①P＜0.05；與si-HOXA-AS3組比較，②P＜0.05；與si-HOXA-AS3+anti-miR-NC組比較，③P＜0.05。

組別si-NC組si-HOXA-AS3組si-HOXA-AS3+anti-miR-NC組si-HOXA-AS3+anti-miR-29a組Beclin1 0.18 ± 0.06 0.83 ± 0.10①0.82 ± 0.11①0.22 ± 0.09②③Caspase-3 0.26 ± 0.18 0.73 ± 0.14①0.75 ± 0.12①0.33 ± 0.10②③LC3II/LC3I 0.15 ± 0.07 0.74 ± 0.08①0.78 ± 0.10①0.16 ± 0.05②③

3 討論

PCa 是男性第二常見的惡性腫瘤，約占男性所有癌癥病例的15%。由于PCa的高發病率和強侵襲性，PCa 被認為是癌癥相關死亡的主要原因之一，尤其是在發達國家。由于前列腺特異性抗原（PSA）檢測的特異性較低，并且患者早期缺乏可識別的癥狀，很大一部分PCa 患者在晚期才被診斷出來，治療效果欠佳，預后較差。近年來研究發現，遺傳基因因素在PCa 的發病機制中發揮重要作用。然而，目前發現的PCa 相關癌基因和抑癌基因作用有限，無法解釋PCa 復雜的發生及轉移機制，因此尚缺乏有效的分子靶向治療途徑。

lncRNA 是一種內源性長鏈非編碼RNA 分子，其本身無蛋白質編碼功能，但其能以表觀遺傳學的形式調控其他基因表達，參與細胞增殖、凋亡、自噬等重要過程。既往研究發現，lncRNA 作為致癌因子或腫瘤抑制因子發揮作用，與腫瘤的發生發展有關，lncRNA 已被認為可能成為未來診斷、治療腫瘤的潛力基因［10］。lncR-HOXA-AS3屬于近期發現的HOXA家族成員之一，因其參與多種惡性腫瘤發生及耐藥而受到關注［11-14］。lncR-HOXA-AS3 在PCa 發病機制中的研究極少。本研究結果顯示，PCa 細胞中lncR-HOXA-AS3 表達異常升高，提示其可能作為致癌因子參與PCa的發病。

自噬是真核生物特有的，自噬和凋亡是維持機體正常的生理平衡和內環境穩定的重要機制，自噬是細胞程序性死亡的途徑之一，與凋亡一樣，在惡性腫瘤發生發展中起關鍵作用［15］。研究發現，lncRNA參與腫瘤細胞自噬和凋亡的調控［16］。本研究結果顯示，沉默lncR-HOXA-AS3 表達，LNCaP 細胞凋亡率明顯上升，凋亡調控關鍵蛋白Caspase-3、自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin 1 蛋白表達均明顯升高，提示沉默lncR-HOXA-AS3 表達能促進LNCaP 細胞凋亡和自噬，lncR-HOXA-AS3 在PCa 發生進展中的作用與其對腫瘤細胞凋亡和自噬的調控有關。

lncRNA 在細胞調控中作用與其對下游靶基因的調控有關。研究發現，許多lncRNA 充當miRNA的內源性競爭性RNA 以調節不同途徑的miRNA 靶向基因表達，從而調控細胞的生物學功能。近期在宮頸癌［17］和胃癌［18］研究中均發現，lncR-HOXA-AS3可靶向miR-29a 參與腫瘤細胞生物學特性的調控。miR-29a 是 miR-29 家族成員之一，其定位于人染色體7q32.3 的負鏈，在機體免疫反應、腫瘤形成等過程中發揮關鍵作用。近期研究表明，miR-29a 在腫瘤發生進展中發揮抑癌因子的作用［19］。目前研究已證實miR-29a 在PCa 細胞和組織中異常低表達，在PCa 的發生進展中起抑癌因子的作用。上調PCa 細胞中miR-29a表達能抑制Pca細胞增殖及轉移，并促進其凋亡和自噬［20-23］。本研究結果顯示，PCa細胞中miR-29a表達異常降低，與既往研究結果一致。且本研究通過雙熒光素酶報告基因結果發現，lncRHOXA-AS3 能靶向miR-29a 抑制PCa 細胞的熒光素酶活性，沉默lncR-HOXA-AS3 表達可上調PCa 細胞中miR-29a表達，并且轉染anti-miR-29a能降低PCa細胞中miR-29a表達，逆轉沉默lncR-HOXA-AS3對PCa 細胞的凋亡和自噬的促進作用。提示抑制lncRHOXA-AS3 對PCa 細胞凋亡和自噬的促進作用，與其對miR-29a基因的靶向調控有關。

綜上所述，Pca 細胞lncR-HOXA-AS3 呈高表達，miR-29a 呈低表達；抑制lncR-HOXA-AS3 能靶向調控miR-29a基因促進PCa細胞凋亡和自噬。