原子力顯微鏡對牙釉質脫礦再礦化的分析

郝麗英， 劉宇峰， 文鶯惠， 鄭賽男

（1.四川大學華西口腔醫學院口腔疾病防治全國重點實驗室，成都 610041；2.成都大學基礎醫學院，成都 610106）

0 引 言

牙釉質在有唾液存在的健康口腔環境中相對穩定，但在以細菌為主的多因素作用下，牙釉質的脫礦及再礦化作用在牙釉質-牙菌斑-唾液界面不斷發生，出現脫礦與再礦化失衡，從而引起齲病的發生。此外，牙釉質脫礦還會引起牙齒中鈣磷的損失［1］、牙釉質表面結構的脫礦［2］、牙齒顯微硬度的降低［3］以及牙齒的齲壞［4-5］。因此，牙釉質的再礦化研究受到學者們的重視。再礦化定義為從口腔中獲得的鈣和磷離子沉積到脫礦的釉質晶體空隙中，從而產生礦物質累積的過程。鈣、磷離子從唾液和菌斑液中重新沉積在脫礦的病變部位，形成新的羥基磷灰石，這些晶體更大，更耐酸溶解［6］，從而更有效地保護牙齒。因此，對牙釉質脫礦及再礦化分析尤為重要。目前，常用的牙釉質脫礦及再礦化分析方法主要包括掃描電子顯微鏡（SEM）和顯微硬度分析。然而，SEM 測試需要對樣本進行噴金的前處理且放大倍數有限，產生樣本無法再次利用、形貌變化指標觀察不清等問題。同時，顯微硬度分析屬于宏觀指標分析，無法進行微觀定量分析。此外，牙釉質脫礦還會引起細菌黏附，傳統的分析方法無法進行黏附力的測試。因此，建立牙釉質脫礦及再礦化的分析實驗尤為重要。

原子力顯微鏡（AFM）是一種觀察材料表面微觀形貌的精密儀器，通過測量樣品表面分子（原子）與AFM 微懸臂探針之間的相互作用力，觀測樣品表面形貌和力學性質［7-8］。將一個對極微弱力極敏感的微懸臂一端固定，另一端有一微小的針尖，針尖與樣品表面輕輕接觸。由于針尖尖端原子與樣品表面原子間存在極微弱的排斥力，使得微懸臂發生形變或運動狀態發生變化。掃描時，傳感器檢測出這些變化，從而獲得作用力分布信息，然后通過控制／反饋系統，將作用力分布信息轉化成分辨率較高的樣品表面結構信息［9］。依據AFM 測試原理，對樣本無須進行前處理，樣本測試完后便可繼續下一步的實驗研究。此外，AFM 不僅可以提供較SEM 放大倍數更高的微觀形貌，還可以提供相應的粗糙度值，甚至可以進行三維重建以及不同脫礦程度的細菌黏附力研究［10-11］。該技術不僅使得樣本的微觀形貌可視化，還可對粗糙度和細菌黏附力等進行量化分析，為實驗教學以及科學研究提供了重要的技術手段［12］。

以脫礦離體牙和再礦化牙釉質為研究對象，通過原子力顯微技術進行脫礦前后形貌差異的表征，并進行三維重建及粗糙度量化，使得形貌變化更為直觀并附有量化信息。此外，采用口腔主要的致齲細菌變異鏈球菌（S.mutans）對AFM 探針進行修飾，分析變異鏈球菌對牙釉質脫礦及再礦化的黏附力，建立牙釉質脫礦及再礦化的分析方法，拓展AFM的功能。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：脫礦液，磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鉀（KCl）、氯化鈣（CaCl2）、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）。以上均為分析純試劑，購自成都科龍試劑公司。腦心浸液培養基（BHI）購于英國Oxoid Ltd.公司，營養瓊脂、蔗糖購于北京生物科技有限公司。實驗所用水均為二次蒸餾水。輕敲模式探針型號為OMCL-AC240TS-C3，接觸模式探針型號為TL-CONT。

儀器：硬組織切割機（Struers Minitom，丹麥）、顯微硬度計（Struers Duramin-2，丹麥）、拋光機（Struters，丹麥）、超聲清洗機（Autoscience，美國）、AFM（SPM-9600，島津，日本）、場發射掃描電子顯微鏡（Inspect F，FEI，美國）。

1.2 牙釉質脫礦及再礦化實驗

（1）牙釉質收集。收集華西口腔醫院因正畸拔除的上下頜前磨牙15 顆，患者年齡在12 ～16 歲，無齲病，形態色澤正常，無明顯裂紋，釉質發育良好，牙體健康，非氟斑牙和四環素牙。去除結石和軟組織，洗凈后放置在蒸餾水中，于4 ℃的冰箱內保存。

（2）切片和包埋。所有標本切除牙根，用鋸式切片機平行于前磨牙頰面并距頰面約2 mm 處低速切片，取得厚度為2 mm 的釉質塊。每顆牙分成2 個牙塊，共30 個牙塊。配制一定比例的環氧樹脂膠，將分割好的牙塊包埋，備用。

（3）打磨。將包埋好的牙塊分別用400 目（目指1 in2面積內網孔數）、800 目、1 000 目、1 400 目、1 800目、2 000 目、2 500 目、3 000 目的砂紙打磨，下底面水平即可，牙釉質面要打磨平滑。在每個牙塊釉面處留有3 mm×3 mm 的開窗區，其余部分用指甲油封閉。

（4）牙釉質脫礦實驗。采用脫礦液進行牙釉質脫礦處理，隨機挑選包埋打磨好的27 個牙塊并隨機分成3 組，每組9 個樣本：A 組（對照組，不浸泡）、B 組（實驗組，浸泡5 s）、C 組（實驗組，浸泡15 s），處理完后將每個樣本均使用清水沖洗約20 s，然后自然干燥后備用。

（5）脫礦牙釉質的再礦化實驗。再礦化溶液配制：130 mmol／L KC1、1.5 mmol／L CaCl2、0.9 mmol／L KH2PO4、20 mmol／L HEPES，調節pH值至7.0［13］。

將上述3 組脫礦牙釉質（27 個，9 個／組）按礦化液浸泡時間不同再分為3 組，每組3 個樣本：D 組（對照組，不浸泡）、E 組（實驗組，浸泡3 d）、F 組（實驗組，浸泡7 d）。浸泡完后用清水清洗干凈，自然干燥后備用。

1.3 細菌培養

變異鏈球菌由四川大學華西口腔醫院口腔疾病研究國家重點實驗室提供，按照細菌常規培養方法培養，獲得細菌混懸液，進行探針的修飾［14］。

1.4 牙釉質脫礦及再礦化分析

采用AFM對牙釉質脫礦及再礦化進行形貌和粗糙度分析，并采用顯微硬度計和場發射掃描電子顯微鏡對脫礦及再礦化牙釉質的顯微硬度和形貌進行驗證分析。

1.5 牙釉質脫礦及再礦化細菌黏附力分析

（1）探針制備［15］。采用無針尖探針，型號為TLCONT。將探針的懸臂梁尖端2／3 浸入質量分數為0.01%的多聚賴氨酸中3 min，取出自然干燥5 min，使得探針表面帶有正電荷。將探針浸入制備好的變異鏈球菌懸液中，5 min后取出探針，自然晾干10 min，然后立即進行黏附力測試。

（2）黏附力測試。將牙釉質樣本固定于樣本臺上，對細菌修飾的探針采用接觸模式，在2 μm ×2 μm范圍、1 Hz頻率下進行黏附力測試。每個樣本隨機選取7 個位點，每個位點測量10 次。

1.6 統計分析

各組的粗糙度值表示為均值±標準差，采用t檢驗法進行兩兩比較。對于黏附力，每個位點采用平均法計算，7 個位點的數據采用中位數計算法獲得最終的黏附力，最后采用Dunn’s 檢驗進行組間的兩兩比較分析。使用SPSS 19.0 軟件進行各組差異比較分析，***p＜0.001 表示有極顯著差異，**p＜0.01 表示有非常顯著差異，*p＜0.05 表示有顯著差異。

2 結果與討論

2.1 AFM對牙釉質脫礦及再礦化的形貌分析

圖1 為牙釉質脫礦及再礦化的AFM 圖。正常牙釉質的釉柱結構［見圖1（a）］經過酸蝕處理5 s［見圖1（d）］和15 s［見圖1（g）］后，釉質表面損壞，呈現出鱗狀的顆粒結構，表面凹凸不平，隨著酸蝕時間的增加，鱗狀顆粒越密，表面微觀形態越粗糙。經再礦化液處理后［見圖1（e）、（f）、（h）、（i）］，釉質上的微孔變少，表面有沉積物填充、覆蓋，表面變得平整；釉質中大蜂窩孔消失，但仍有微孔存在，雖然釉面上礦物質重結晶增多，但是致密感依然不如未脫礦的牙釉質。隨著再礦化時間增長，釉質表面更加平整、致密，覆蓋物更多。綜上表明，AFM可對牙釉質脫礦及再礦化的微觀形貌進行分析。

圖1 牙釉質脫礦及再礦化的AFM圖

2.2 AFM對牙釉質脫礦及再礦化的量化分析

AFM可進一步對牙釉質的粗糙度進行量化分析，為實驗教學和科學研究提供更直觀的數據支撐。如圖2（a）及表1 所示，隨著酸蝕時間的增加，粗糙度增大，且組間均存在統計學差異。如圖2（b）及表1 所示，隨著再礦化時間的增加，粗糙度呈現降低的趨勢，表明酸蝕時間越長，牙釉質表面破壞程度越大，再礦化可以對牙釉質表面有一定的修復作用，而且再礦化時間越長，對牙釉質的修復效果越好。根據表2、3 的統計分析，相同脫礦時間下牙釉質經過不同時間的再礦化處理后，粗糙度兩兩比較均有統計學差異；不同脫礦時間下牙釉質經過相同時間的再礦化處理后，粗糙度兩兩比較也均有統計學差異。

表1 不同脫礦處理的牙釉質在不同再礦化時間下的粗糙度值

表3 不同再礦化時間下的牙釉質表面粗糙度比較

2.3 SEM和顯微硬度測試對牙釉質脫礦及再礦化的驗證

選用SEM對牙釉質脫礦及再礦化的形貌進行表征。如圖3 所示，正常牙釉質表面致密平整［見圖3（a）］，當脫礦5 s后［見圖3（d）］，釉柱結構被酸溶解，牙釉質表面呈現疏松狀態，脫礦時間越長牙釉質表面被酸溶解越嚴重［見圖3（g）］。當脫礦牙釉質經過再礦化處理后，牙釉質表面沉積一層絮狀礦物質，表面變得平整、致密，并隨著再礦化時間的增加，牙釉質表面變得更為平整、致密。脫礦牙釉質在再礦化液處理下，再礦化液中鈣、磷離子累積所形成的羥基磷灰石晶體覆蓋于牙釉質表面，使牙釉質表面更加平整、致密。SEM 形貌表征結果與AFM 形貌表征結果一致，但是在SEM測試前需要對樣本進行噴金處理，造成樣本無法重復利用，而且不能提供相應的粗糙度值。

圖3 牙釉質脫礦及再礦化后的SEM圖

此外，采用顯微硬度測試進一步驗證粗糙度。由不同時間脫礦后牙釉質表面顯微硬度圖（見圖4）可見，脫礦5 s組［見圖4（b）］較脫礦0 s組［見圖4（a）］菱形圖案變大，脫礦15 s 組［見圖4（c）］菱形圖案更大。由圖4（d）的硬度值分析可知，隨著脫礦時間的增長，牙釉質表面逐漸由緊致變得疏松，牙釉質表面的顯微硬度也隨之降低。柱狀圖［見圖4（d）］分析表明，脫礦時間5 s組、脫礦時間15 s 組均具有統計學意義（**p＜0.01）。脫礦時間5 s 組和0 s 組相比，脫礦時間5 s組具有明顯的統計學差異（***p＜0.001）。脫礦時間15 s 組顯微硬度更低，存在明顯的統計學差異（***p＜0.001），表明脫礦后牙釉質的釉柱和柱間質流失，釉質崩塌，硬度降低，脫礦時間越長牙釉質表面顯微硬度越低，與AFM 的粗糙度分析結果一致。圖4中，1 VHN ＝9.807 MPa。

由表4 可知，隨著再礦化時間的增加，牙釉質的形態逐漸由疏松變得緊致，牙釉質表面的顯微硬度也隨之升高。由圖5 和表5、6 可知，在相同的脫礦時間下，再礦化3 d和7 d組較未再礦化組均存在統計學差異，再礦化時間越長差異越大，表明再礦化液對脫礦后牙釉質的表面顯微硬度有一定的恢復效果，再礦化時間越長顯微硬度越大。以上結果與AFM 再礦化后的粗糙度值分析結果一致，驗證AFM量化測試的可行性。

表4 不同脫礦時間、再礦化時間下牙釉質表面硬度值

表5 不同脫礦化時間下牙釉質表面硬度比較

表6 不同再礦化時間下牙釉質表面硬度比較

圖5 脫礦牙釉質再礦化的硬度柱狀圖

2.4 AFM對牙釉質脫礦及再礦化的細菌黏附力分析

變異鏈球菌和不同脫礦時間下牙釉質表面黏附力曲線如圖6（a）所示。由曲線的后退部分（紅色）可以看出，變異鏈球菌和不同脫礦時間下牙釉質黏附力具有明顯的差異。當細菌修飾的探針慢慢接近被研究的牙釉質，兩者之間距離為500 nm 左右時，探針受到指數增加的排斥力（紅色線），被迫離開牙釉質表面。由于細菌與牙釉質存在一定的黏附力，使得探針懸臂梁發生形變，再離開一定距離后，細菌和牙釉質之間的結合斷裂，從而產生最大的黏附峰（黏附力）。由于不同脫礦時間的牙釉質表面粗糙度存在統計學差異，因此細菌和牙釉質間的結合力也不一樣，探針懸臂梁產生的最大彈性形變也不相同。力曲線［見圖6（a）］和定量分析柱狀圖［見圖6（b）］表明，變異鏈球菌對不同脫礦時間的牙釉質均存在表面黏附力，隨著粗糙度的增加黏附力增大，并存在明顯的統計學差異。這可能是由于：粗糙度越大，牙釉質表面的黏附位點越多，為細菌黏附提供更多位點凹陷的表面結構，也可為細菌提供更多的生存空間，更有利于細菌的黏附。當脫礦牙釉質經過再礦化處理后，由于牙釉質表面形成了一些羥基磷灰石晶體，使得表面粗糙度有所降低。同時，由定量分析柱狀圖（見圖7）可知，對相同再礦化時間的牙釉質而言［見圖7（a）］，脫礦嚴重的牙釉質的細菌黏附力依然較高，但均低于未再礦化處理組；對相同脫礦時間的牙釉質而言［見圖7（b）］，隨著再礦化時間的增加，細菌黏附力降低，尤其是脫礦15 s 的牙釉質經過再礦化處理后，細菌黏附力降低更為顯著，但是均高于未脫礦的黏附力，表明粗糙度影響細菌對牙釉質的黏附力，并且再礦化處理有助于降低細菌黏附力，從而有效降低患齲病的概率。

圖6 變異鏈球菌和不同脫礦時間下牙釉質表面黏附力分析

圖7 變異鏈球菌和不同脫礦時間、再礦化時間下牙釉質表面黏附力柱狀圖

3 結 語

AFM為牙釉質脫礦及再礦化分析提供直觀成像和數據量化的技術支持。通過AFM 技術分析脫礦及再礦化處理的牙釉質形貌、粗糙度變化，進一步利用AFM技術研究口腔致齲菌變異鏈球菌對脫礦及再礦化牙釉質的黏附力。結果表明，隨著酸蝕時間的增加，牙釉質表面出現鱗狀顆粒，結構疏松，粗糙度變大，細菌黏附力增加；經過再礦化處理后，牙釉質表面變得更為致密，粗糙度和黏附力均有所降低。同時，采用SEM和顯微硬度儀從形貌和硬度兩方面驗證了AFM成像和量化數據的可靠性。