萊陽地區雞場沙門菌分離鑒定與耐藥性分析

萬惠愚

摘要：為了分析萊陽地區雞場中沙門菌的流行情況和耐藥性情況，2022-2023年采集萊陽地區中56個雞場中疑似沙門菌感染的雞的肛拭子、糞便、肝臟、脾臟及腎臟病料組織樣品213份，采用細菌分離培養、革蘭氏染色、生化試驗鑒定及PCR擴增鑒定等多種方法進行沙門菌分離鑒定。采用人工感染試驗動物和K-B藥敏紙片法對分別檢測分離的沙門菌的致病性及對常用藥物的耐藥性。結果表明，從萊陽地區中56個雞場中疑似沙門菌感染的雞的肛拭子、糞便、肝臟、脾臟及腎臟病料組織樣品213份中分離得到119株沙門菌，其中82株菌可以引起雛雞的發病與死亡，對雛雞的死亡率在40%之間；82株致病性沙門菌對磺胺間甲氧嘧啶、多西環素、新霉素等8種藥物耐藥率在58.5%～100.0%之間，對其他藥物存在不同程度耐藥性。結果表明，從萊陽地區雞場中得到92株致病性沙門菌對常用的抗菌藥產生不同的耐藥性。本研究為萊陽地區雞場中沙門菌的流行病調查及指導臨床合理用藥提供參考依據。

關鍵詞：雞；沙門菌；分離鑒定；致病性；耐藥性

隨著我國畜牧業的發展，我國的蛋雞和肉雞的養殖數量呈現逐年升高的趨勢，蛋雞和肉雞的養殖模式已經形成規?；?、集約化的養殖模式，我國成為蛋雞和肉雞生產與消費大國，在蛋雞和肉雞的養殖過程中，沙門菌成為危害我國蛋雞和肉雞的主要細菌性疾病之一[1]。國內外許多相關研究表明，不同血清型的沙門菌在世界各個國家不同地區的雞場中廣泛流行，尤其是不同血清型的沙門菌在不同地區中蛋雞和肉雞的種雞場中流行，主要由于該菌可以通過水平傳播和垂直傳播，目前沒有有效的沙門菌疫苗對種雞場進行免疫，也是導致不同血清型沙門菌在不同地區蛋雞和肉雞的種雞場中流行的主要因素之一[2]。沙門菌不僅可以引起豬、雞、鴨、鵝、牛、羊等多種動物發病，同時也是臨床中常見的食源性病原菌之一，該菌可以作為主要的食源性病原菌引起人的感染，人通過食源性感染沙門菌，該菌感染人后臨床中主要以腸炎、腹瀉為主，嚴重者可以導致其死亡，因此，沙門菌成為臨床中重要的人畜共患的病原菌[3-4]。相關研究表明，雞、鴨、鵝等家禽是沙門菌主要的攜帶宿主之一，該菌在不同地區不同雞場中廣泛流行，尤其是對蛋雞和肉雞的種雞場中沙門菌的凈化與防控具有重要的意義[5]。在蛋雞和肉雞的養殖過程中由于沒有有效的疫苗，主要通過抗菌藥物進行治療，由于抗菌藥物的不合理使用，大部分從蛋雞和肉雞場中分離得到的沙門菌對常用的抗菌藥物產生很強的耐藥性，且出現對臨床中常用的藥物出現多重耐藥性[6]。因此，對蛋雞和肉雞場中沙門菌的監測具有重要的意義。本研究以萊陽地區中56個雞場中疑似沙門菌感染的雞的肛拭子、糞便、肝臟、脾臟及腎臟病料組織樣品213份中分離的沙門菌為研究對象，對其致病性、抗菌藥物的耐藥情況檢測，為減少耐藥性傳播和指導臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源

2022—2023年采集萊陽地區中56個雞場中疑似沙門菌感染的雞的肛拭子、糞便、肝臟、脾臟及腎臟病料組織樣品213份。

1.2 細菌分離培養

將采集的病料組織樣品經過處理后，無菌的條件下接種于沙門菌顯色培養基中進行沙門菌鑒別培養，37 ℃恒溫培養箱培養12～18 h后，挑取優勢的單個菌落按照說明書進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其分離菌株的形態學。

1.3 細菌生化鑒定

無菌的條件下，將沙門菌顯色培養基上典型菌落接種于普通營養肉湯中，37 ℃恒溫振蕩培養8～12 h，按照梅里埃革蘭陰性菌鑒定試紙條說明書，將純化培養的菌株在無菌的條件下接種到梅里埃革蘭陰性菌鑒定試紙條中，37 ℃培養12～18 h后，進行比對確定其生化特性。

1.4 細菌的PCR鑒定

參考文獻[7]報道的，采用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，在生工生物工程（上海）股份有限公司合成細菌通用引物16SrRNA基因序列，F1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'；F2：5'- TACGGCTACCTTGTTACGACTTG-3'；目的條帶為1 500 b。采用細菌通用引物以提取的分離菌株的基因組DNA為模板進行PCR鑒定。將分離菌株檢測為陽性的PCR產物回收送華大基因公司測序與比對。

1.5 致病性試驗

將分離的沙門菌在無菌的條件下普通營養肉湯中培養至對數期，用無菌的營養肉湯調整分離菌株的菌液濃度為108 cfu/mL，攻毒組每1株分離菌株通過腹腔注射攻毒5只1日齡雛雞，每1只雛雞的攻毒劑量為0.2 mL，對照組的雛雞給予等量的無菌PBS。在致病性試驗期間（7 d）觀察雛雞的發病死亡情況。

1.6 藥敏試驗

無菌的條件下將沙門菌顯色培養基長出的典型菌落接種于普通營養肉湯中培養至對數期，調整分離菌株菌液濃度為108 cfu/mL，參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2013年推薦的標準藥敏試驗法進行操作和試驗結果判斷[8]。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定

疑似沙門菌分離菌株在沙門菌顯色培養基上長出淺綠色的大小一致的菌落，對純化的菌株經革蘭氏染色顯微鏡觀察其形態學可見單個或者聚在一起的兩頭鈍圓的革蘭氏陰性的桿菌（圖1）。與《伯杰細菌鑒定手冊》中報道的沙門菌的培養特性及形態學基本上一致。

2.2 細菌生化試驗鑒定

通過梅里埃革蘭陰性菌鑒定試紙條對分離菌株進行生化鑒定，結果顯示，119株臨床分離菌株的生化特性與《伯杰細菌鑒定手冊》中報道的沙門菌的生化特性基本上一致。分離的119株臨床分離株初步鑒定為沙門菌。

2.3 細菌的PCR鑒定結果

對臨床中分離的菌株用細菌通用引物16S rRNA進行PCR鑒定。PCR鑒定結果顯示，119株沙門菌分離菌株均擴增出大約為1 500 bp的目條帶（部分菌株見圖2）。通過測序臨床中分離的119株菌株的基因序列與GenBank中登錄沙門菌的同源性高達98%以上，其臨床分離菌株鑒定為沙門菌。

2.4 致病性試驗

攻毒組的雛雞在攻毒后2～6 d出現不同的發病與死亡情況，個別的雛雞未表現任何臨床癥狀出現死亡。從死亡的雛雞體內分離得到沙門菌，在整個攻毒試驗期間對照組的雛雞健康的存活。不同的分離菌株對雛雞的致死率在40%～100%之間，經過統計82株為致病性沙門菌。

2.5 耐藥性分析結果

結果由表1可知，臨床中分離的82株致病性沙門菌對磺胺間甲氧嘧啶、多西環素、新霉素等8種藥物耐藥性較強，耐藥率在58.5%～100.0%之間；對頭孢噻呋、頭孢噻肟、氟苯尼考等8種藥物的耐藥率在3.7%～30.5%之間。

3 討論

雞沙門菌病是由不同血清型致病性沙門菌引起的一種雞的細菌性傳染病，該菌主要分為雞白痢、禽傷寒及副傷寒等，該菌可以感染不同階段的雞，其中以雛雞最易感，臨床中以敗血癥、腸炎、腹瀉為多見，該菌對雛雞的感染率和死亡率均較高，給養雞業造成嚴重經濟損失[8-9]。近幾年，國內關于雞場中沙門菌的流行報道的越來越多。本試驗研究表明，從采集的56個雞場中213份樣品中分離得到82株致病性沙門菌，說明該地雞場中沙門菌在廣泛流行，應該注意雞場中沙門菌的凈化與綜合防控。國內相關研究表明，雞場中流行的沙門菌的耐藥性也逐年增加，存在多重耐藥現象，給該菌的防治帶來一定困難[10]。本試驗研究表明，臨床中分離的82株致病性沙門菌對常用的抗菌藥物產生嚴重的耐藥性。許多相關研究表明雞場中流行的沙門菌的耐藥性很普遍，在臨床中應該引起重視，合理使用抗菌藥物，減少耐藥性的產生。

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