骨炎消方通過PI3K/Akt/mTOR信號通路對骨關節炎細胞自噬的影響*

高小鳳，王寶娟，才賀，鄭曙光

（1.貴州中醫藥大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院骨傷科，貴州 貴陽 550002）

骨關節炎（Osteoarthritis, OA）是年齡、肥胖、炎癥、創傷、遺傳等多種原因導致的關節變性疾病[1]，其主要表現包括骨關節軟骨破壞、軟骨下骨硬化或囊性變、關節邊緣骨質增生、滑膜病變、關節囊攣縮、韌帶松弛或攣縮及肌肉萎軟乏力[2]。OA發病以中老年為主，女性多于男性，且傷殘發生率較高。目前治療藥物以非甾體抗炎藥居多[3]，病程后期治療主要采用外科手術，如關節置換等[4]。軟骨細胞是軟骨中唯一的駐留細胞，可以維持軟骨的周轉平衡，OA發生時軟骨細胞大量損失[5]。近幾年來，關于雷帕霉素靶基因表達途徑（PI3K/Akt/mTOR）與OA之間的關系已成為一個熱門課題。PI3K/Akt/mTOR信號通路由酶聯受體介導，能被生長因子、細胞因子、細胞外基質等多種因子活化[6-7]。目前OA的發病機制尚未完全清楚，因此，探討其與PI3K/Akt/mTOR的信號轉導途徑的關系及延緩其發生、發展具有十分重要的意義。骨炎消方是苗族的傳統方劑，其在黔南和黔東南一帶OA的治療當中發揮重要作用，其療效可靠，作用全面，無明顯不良影響[8]。本研究以骨炎消方為主要治療手段，通過實驗觀察其對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響，探討骨炎消方對OA的預防及治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

兔軟骨細胞（CP-Rb038）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物及制備

骨炎消方由12味藥物組成，其中大血藤、黑骨藤、狗脊、雞血藤、杜仲、淫羊藿、伸筋草、透骨香、骨碎補均采購自貴陽同仁堂藥房（生產批號：210501），蜘蛛香、飛龍掌血、小血藤均購自萬東橋下藥材市場，經貴州中醫藥大學藥學院王波講師鑒定均為正品。上述12味藥物各取10 g，常規水煎制，用旋轉蒸發儀對水煎液減壓濃縮，再用冷凍干燥機凍干，最后獲得10 g棕褐色凍干粉，采用無菌PBS完全溶解骨炎消凍干粉，用100 μm篩網過濾雜質，最后使用0.22 μm濾網過濾除菌，藥物濃度為100 mg/mL，置入-80 ℃冰箱冷凍保存備用。

1.3 實驗儀器與試劑

旋轉蒸發儀（上?？婆d儀器有限公司），冷凍干燥機（上海舜制儀器制造有限公司），酶標儀（上海賽默飛世爾科技公司），PCR儀（北京東勝創新生物科技有限公司），化學發光成像系統（上海賽默飛世爾科技公司），倒置顯微鏡（上海徠卡顯微系統有限公司），離心機、超凈臺、細胞培養箱（上海賽默飛世爾科技公司），胎牛血清（南京維森特生物技術有限公司），DMEM培養基（上海賽默飛世爾科技公司），胰酶（南京維森特生物技術有限公司），青霉素-鏈霉素雙抗、D-氨基酸葡萄糖（北京索萊寶科技有限公司），脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8試劑盒（美國MedChemexpress生物科技公司），自噬蛋白5（autophagy protein 5, ATG5）和自噬蛋白12（autophagy protein 12, ATG12）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海源桔生物科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 軟骨細胞炎癥模型構建 選取第3代對數生長期的軟骨細胞，待其細胞融合度達80%時加入LPS 10.0 μg/mL，處理24 h。用無菌刮刀收集細胞懸液，離心后用PBS清洗2次，再次離心10 min，加入0.3 mL生理鹽水進行勻漿，冰浴條件下超聲破碎，用NO試劑盒測定制備好的勻漿液，確定軟骨細胞模型是否復制成功。

1.4.2 CCK-8法檢測細胞增殖率 3代軟骨細胞接種于含完全培養基的96孔板中，細胞密度為5×105個/mL，每孔100 μL，待細胞貼壁后，吸棄培養液，PBS清洗2遍，更換含有LPS（10.0 μg/mL）的DMEM培養基將骨炎消藥物分別稀釋至所需濃度（1.0 ng/mL、0.1 μg/mL、1.0 μg/mL、10.0 μg/mL、100.0 μg/mL、1.0 mg/mL和10.0 mg/mL），細胞培養箱中孵育24 h后，每孔加入100 μL CCK-8試劑，37 ℃避光孵育4 h，用酶標儀測定各孔溶液在波長450 nm處的光密度（optical density, OD）值，根據OD值計算細胞加藥后的增殖率，進而選取合適濃度的骨炎消進行后續實驗。

1.4.3 ELISA檢測細胞上清液中自噬因子水平 將軟骨細胞隨機接種于6孔板中，用配置好的完全培養基進行稀釋，最終將細胞密度調整為1×105個/mL，每孔加入2 mL培養液，待細胞融合至80%后，分6組進行培養：空白組（兔軟骨細胞+完全培養基），模型組（兔軟骨細胞+含10 μg/mL LPS培養基），陽性組（兔軟骨細胞+ LPS+含150 μmol/L的D-氨基葡萄糖培養基），其余3組分別加入含骨炎消1.0、10.0和100.0 μg/mL的培養基處理1 h，為避免細胞過多死亡造成實驗誤差，再加入10.0 μg/mL的LPS處理24 h。細胞培養24 h后，收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟進行后續操作。

1.4.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測細胞PI3K、Akt、mTOR基因相對表達量 用TRIzol法提取RNA，用微量分光光度計測定OD260、OD280及OD260/OD280值，計算RNA的純度和濃度，總RNA濃度（μg/μL）=OD260×40×10-3。將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR檢測。qRT-PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，95℃再升溫15 s；共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。引物序列見表1。

1.4.5 Western blotting檢測PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1蛋白相對表達量 用RIPA裂解液提取細胞蛋白，BCA法測定各蛋白的濃度，添加蛋白上樣緩沖液后加熱變性。SDS-PAGE電泳，根據蛋白大小調整轉膜時間，5%的脫脂奶粉室溫條件下封閉2 h。一抗孵育4 ℃過夜（GAPDH、PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1均為1∶1 000）。二抗常溫孵育2 h（1∶10 000），ECL發光液顯影，用Image J軟件處理分析。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 26.0和Graphpad Prism 9.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 軟骨細胞炎癥模型的構建

正常軟骨細胞呈橢圓形或短梭形，胞質豐富，胞核清晰，單層生長的細胞均勻地貼在細胞瓶壁。用LPS誘導一段時間后的軟骨細胞形狀不規則且細長，有偽足樣觸手伸出，相較于正常軟骨細胞，LPS誘導后的軟骨細胞有部分漂浮且貼壁細胞的數量減少，分布疏散?？瞻捉MNO含量為（37.35±2.47）μmol/L，模型組NO含量為（146.00±2.17）μmol/L，兩組比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=65.609，P=0.000）。見圖1。

圖1 軟骨細胞形態 （倒置顯微鏡×100）

2.2 不同濃度骨炎消對軟骨細胞存活率的影響

CCK-8法檢測結果顯示，各組軟骨細胞存活率比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=168.930，P=0.000）。骨炎消1.0 ng/mL組和骨炎消10.0 mg/mL組的細胞存活率與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；剩余骨炎消不同濃度組的細胞存活率與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中骨炎消1.0 μg/mL組、骨炎消10.0 μg/mL組、骨炎消100.0 μg/mL組細胞增殖率升高最為明顯，因此選取這3組作為后續實驗當中的骨炎消高、中、低劑量組。見表2。

表2 不同濃度骨炎消對軟骨細胞存活率的影響 （±s）

表2 不同濃度骨炎消對軟骨細胞存活率的影響 （±s）

注：①與空白組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組骨炎消1.0 ng/mL組骨炎消0.1 μg/mL組骨炎消1.0 μg/mL組骨炎消10.0 μg/mL組骨炎消100.0 μg/mL組骨炎消1.0 mg/mL組骨炎消10.0 mg/mL組F 值P 值細胞存活率%100.00±0.67 52.29±1.61①54.83±1.49①63.05±1.14①②75.3±0.42①②81.5±1.23①②87.1±3.20①②60.04±1.54①②52.79±2.25①168.930 0.000

2.3 各組細胞上清液中自噬因子水平

各組細胞上清液中自噬因子ATG5和ATG12水平比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與空白組比較，模型組、陽性組及骨炎消高、中、低組的ATG5和ATG12水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組和骨炎消高、中、低組的ATG5和ATG12水平均升高（P＜0.05），但模型組的ATG12水平與骨炎消低劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組細胞中自噬因子水平比較 （ng/mL，±s）

表3 各組細胞中自噬因子水平比較 （ng/mL，±s）

注：①與空白組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性組骨炎消高劑量組骨炎消中劑量組骨炎消低劑量組F 值P 值ATG12 29.88±0.78 10.60±0.58①17.55±0.57①②20.52±0.81①②18.28±0.97①②12.89±0.09①79.981 0.000 ATG5 27.80±0.57 7.18±0.42①15.60±0.36①②19.00±0.73①②14.63±0.80①②10.93±0.12①②125.317 0.000

2.4 骨炎消對軟骨細胞中PI3K、Akt、mTOR基因相對表達量的比較

6組軟骨細胞中PI3K、Akt、mTOR基因相對表達量比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與空白組相比，模型組PI3K、AKT、mTOR相對表達量均升高（P＜0.05）；與模型組相比，骨炎消高、中、低組PI3K、Akt、mTOR相對表達量均降低（P＜0.05），且骨炎消各劑量組中的基因相對表達量隨濃度降低而上升。見表4。

表4 各組PI3K、Akt、mTOR mRNA相對表達量比較（±s）

表4 各組PI3K、Akt、mTOR mRNA相對表達量比較（±s）

注：①與空白組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性組骨炎消高劑量組骨炎消中劑量組骨炎消低劑量組F 值P 值mTOR mRNA 1.01±0.08 3.72±0.08①2.17±0.04②1.58±0.03②1.77±0.06②1.91±0.03②8.411 0.001 PI3K mRNA 1.00±0.04 2.44±0.05①1.71±0.08①1.31±0.05②1.51±0.09②1.57±0.06②9.224 0.001 Akt mRNA 1.00±0.03 2.03±0.09①1.53±0.09①1.24±0.07②1.44±0.07②1.48±0.06②8.911 0.001

2.5 骨炎消對軟骨細胞中PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1蛋白相對表達量比較

各組軟骨細胞中PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與空白組比較，模型組PI3K、Akt、mTOR蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性組和骨炎消高、中劑量組的PI3K、Akt、mTOR蛋白相對表達量均降低（P＜0.05），而骨炎消低劑量組的PI3K、Akt、mTOR蛋白相對表達量與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與空白組比較，模型組Beclin-1的蛋白相對表達量降低（P＜0.05），與模型組比較，陽性組和骨炎消高、中、低組Beclin-1蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見圖2和表5。

圖2 各組細胞蛋白條帶圖

表5 各組軟骨組織PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1蛋白相對表達量比較 （±s）

表5 各組軟骨組織PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1蛋白相對表達量比較 （±s）

注：①與空白組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性組骨炎消高劑量組骨炎消中劑量組骨炎消低劑量組F 值P 值Beclin-1蛋白1.00±0.00 0.19±0.05①0.84±0.02①②0.82±0.03①②0.58±0.02①②0.39±0.03①②112.811 0.000 PI3K蛋白1.00±0.07 1.80±0.05①1.33±0.03①②1.19±0.03②1.49±0.07①②1.72±0.06①30.313 0.000 Akt蛋白1.00±0.05 1.71±0.05①1.32±0.02①②1.17±0.05②1.44±0.03①②1.60±0.03①43.874 0.000 mTOR蛋白1.00±0.12 2.52±0.10①1.45±0.03②1.28±0.08②1.86±0.15①②2.28±0.15①26.732 0.000

3 討論

骨關節炎是一種慢性退行性疾病，常見于中老年人群，其與年齡、肥胖、遺傳等因素密切相關，且其自身的修復能力有限[9]?！?015年中國骨關節炎防治認知白皮書》指出，全世界有3.6億骨關節炎患者，我國約1.2億人正在經受著骨關節炎的折磨，＞60歲的老年人中有一半以上患有此病，其發病率遠超心腦血管疾病，致殘率高，嚴重影響患者的生活自理能力和勞動能力[10]。針對OA的治療，大部分患者采用口服鈣類和氨基酸葡萄糖類產品，而骨關節炎的核心病理過程是關節軟骨的破壞，所以僅通過補鈣是不能達到治療目的的，而氨基酸葡萄糖類產品具有軟骨保護和結構改善性作用，故廣泛用于OA的預防與治療[9，11]。本實驗采用D-氨基酸葡萄糖作為陽性藥物對照組，藥物濃度的設定是課題組前期依據DODGE博士[12]的實驗研究引用而來。

骨炎消方原是黔南、黔東南等地苗族人民用于治療OA的經典驗方，上述12味藥物合用，具有通氣活血、疏經活絡、祛風除濕，表出毒邪之功。在苗醫理論中，將骨關節炎稱為“冷骨風”，有“壅塞為病，通達為康”“身不通則痛”的說法。治療原則是依據“熱病冷治，冷病熱治；弱漏用補，邪重用攻”[13]，這與中醫學的治療原則的理論是相通的。苗醫依其治療原則創造了“熏蒸法”“弩針藥法”“紙火療法”等外治法來治療此類疾病[14-15]。前期研究發現，骨炎消有改善小鼠耳發熱、紅腫等炎性癥狀，提示骨炎消具有消炎鎮痛、改善關節功能的作用[16]；同時發現，苗族熏蒸療法對于骨關節炎的治療效果較為突出。王興桂等[17]采用骨炎消熏蒸療法對家兔早期OA進行局部干預，結果發現骨炎消主要是通過上調Bcl-2表達和下調Bax表達從而保護軟骨細胞免受凋亡。前期研究證實骨炎消方對OA的病理狀態有明顯的改善作用，并且發現骨炎消方在調控凋亡方面也對軟骨細胞具有保護作用，在此基礎上，本文將進一步探究骨炎消方通過PI3K/Akt/mTOR信號通路影響細胞自噬用于治療OA的作用機制。

PI3K/Akt/mTOR通路作為細胞內重要的信號轉導通路之一，具有影響細胞的生長、存活、增殖、凋亡、自噬、血管生成及蛋白合成等作用，并在此過程中發揮著重要的生物學調控功能[18]。PI3K/Akt/mTOR信號通路典型的活化途徑是由受體酪氨酸激酶或G蛋白結合受體啟動的，活化的PI3K將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸轉化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，并進一步激活下游底物如Akt[19]?；罨蟮腁kt激活各種下游底物，如mTOR等。而mTOR作為自噬相關的調節因子，與自噬的啟動呈負相關[20]，因此，通過干預該信號通路可以影響細胞自噬。

自噬（Ⅱ型程序性細胞死亡）是一種特殊的生命現象，在一定的環境下，細胞內的溶酶體可以分解損傷的細胞器和大分子，從而達到生物合成或產生能量的目的，具有保護組織細胞、提供能量的作用[21]。自噬還是一種復雜的代謝途徑，受多種信號通路影響，有研究證實，mTOR是自噬最為核心的調節因子[22]。卓清緣等[23]應用樺木酸調控人結腸癌細胞SW620發現，細胞自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表達明顯升高，驗證其作用機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。另有實驗證明，采用PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白抑制劑誘導大鼠軟骨細胞，細胞自噬率增加，Atg5和Atg7的基因表達及LC3、Beclin1和p62的蛋白表達顯著上調，提示抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可促進關節軟骨細胞的自噬，減輕骨性關節炎大鼠的炎癥反應[24]。由此可見，當上游的PI3K/Akt被抑制后，下游的mTOR同樣也會被抑制，這時的自噬表達會上升。

ATG5、ATG12與Beclin1是重要的自噬因子。王秀閣等[25]應用解毒通絡保腎方作為治療藥物，作用于SD大鼠及體外實驗高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞（HBZY-1），結果顯示解毒通絡保腎方干預后，腎組織中Beclin-1、ATG5蛋白表達上升，與模型組相比，解毒通絡保腎方抑制高糖誘導的HBZY-1細胞增殖，細胞中ATG5蛋白表達上升。而本研究結果也證明,當PI3K相對表達量升高，下游的Akt、mTOR相對表達量也隨之升高，骨炎消治療后PI3K、Akt、mTOR相對表達量均隨著濃度升高而降低。與模型組比較，骨炎消各劑量組的ATG5、ATG12表達量增加，且骨炎消高、中劑量組的Beclin-1蛋白條帶灰度顯影與模型組相比均有不同程度加深。

綜上所述，骨炎消方有防治OA的作用，其作用機制可能為抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，引起自噬相關因子在一定程度上調，促進細胞增殖分化。本研究初步探討PI3K/Akt/mTOR信號軸在骨炎消治療OA中的作用，為OA的治療提供新的思路和靶點，但僅限于細胞實驗，后續仍需進一步采用動物實驗來驗證此結論。