面部激素依賴性皮炎患者外周血單一核細胞SOCS1、CKLF1的表達及祛風清熱涼血方的療效

成 娟,陳 宏,劉德華,馮 爽

(1.天津市人民醫院皮膚科,天津 300121;2.晉城市人民醫院皮膚科)

面部激素依賴性皮炎(FCDD)是由于長期在面部不當使用外用糖皮質激素而引起的慢性炎性反應疾病,具體發病機制目前尚未明確,但近期研究發現T輔助細胞(Th)亞群分化失衡所引起的皮膚免疫功能異常與FCDD發病關系密切,而細胞因子信號傳導抑制因子1(SOCS1)與趨化素樣因子1(CKLF1)在Th細胞免疫平衡中扮演了重要的角色。為了進一步探索SOCS1與CKLF1的作用和臨床意義,本文研究了SOCS1與CKLF1 mRNA在FCDD患者PBMC中的表達,并觀察祛風清熱涼血方治療熱毒熾盛證FCDD患者的療效及對兩種細胞因子表達變化的影響,進而為祛風清熱涼血方治療FCDD機制的闡明提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2015年3～12月天津市人民醫院確診為FCDD且中醫辨證為熱毒熾盛證患者50例為FCDD組,其中男8例,女42例,年齡18～62歲,平均(36.14 ±11.02)歲,對照組為同期正常體檢的40例正常人,其中男13例,女27例,年齡18～64歲,平均(41.15±14.47)歲。兩組性別、年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05)。FCDD組口服祛風清熱涼血方顆粒劑(方劑主要藥物:生地黃、生石膏、水牛角、玄參、白鮮皮、知母、荊芥、防風、牛蒡子、金銀花、連翹、白茅根、黃芩、黃柏、苦參、升麻、白芍、甘草,廣東一方制藥廠生產),每日1劑,沖服?？诜幬锿瑫r給予0.9 %生理鹽水冷敷面部,外用玉澤精華乳,2次/d,檢測患者首診及治療2 w(隨訪到33例患者)、4 w(隨訪到19例患者)時PBMC SOCS1 mRNA、CKLF1 mRNA 的表達情況。診斷標準:根據2009年中國醫師協會皮膚科分會美容專業組提出的《激素依賴性皮炎診治指南》與第四版《中國臨床皮膚病學》及文獻[1]制定,納入標準為熱毒熾盛證FCDD患者。排除標準:1個月內系統使用糖皮質激素、抗生素、免疫抑制劑、抗組胺藥治療;合并(真菌、細菌、病毒)感染者;肝腎功能損害或其他系統疾病者;患有過敏性疾病、銀屑病等影響試驗結果的疾病;妊娠及哺乳期婦女;對方中草藥成分過敏者;未能按時隨診,不能按時服藥或不能耐受藥物不良反應的患者。評分依據近年FCDD相關文獻[2-3],采用4級評分法對患者的主觀、客觀指標進行評分。療效評價標準:根據尼莫地平法計算公式計算療效指數,痊愈:皮損幾乎完全消退,自覺癥狀消失,療效指數>90%;顯效:皮損明顯消退,自覺癥狀有明顯的減輕,60%<療效指數≤90%;有效:部分皮損消退,自覺癥狀有所減輕,20% <療效指數≤60%;無效:極少部分皮損消退,自覺癥狀變化不明顯甚至加重,療效指數≤20%?？傆行?(痊愈例數+顯效例數+有效例數)/總例數×100%。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意并與患者簽署了知情同意書。

1.2儀器與試劑:RNAisoplus、RT-PCR試劑盒、引物(內參GAPDH、SOCS1、CKLF1,且引物終濃度均為10 μmol/L)(大連寶生物工程有限公司);焦炭酸二乙酯(DEPC)(大連寶生物工程有限公司);實驗室超純水系統ELGAPURELAB Ultra(英國 ELGA Lab Water公司);小型高速冷凍離心機5415D、臺式高速大容量離心機5804R、核酸蛋白測定儀(德國eppendorf公司);實C-1000型熒光定量 PCR 儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法:本試驗所有樣本均抽取2 ml外周靜脈血,EDTA抗凝,-80℃低溫凍存。參照試劑盒操作說明提取單個樣本總RNA,總RNA濃度和純度的測定,總RNA完整性的檢測,逆轉錄合成cDNA,SYBR Green I 實時熒光定量 PCR,PCR 產物電泳?；虻南鄬Χ坑忙T表示(Ct值表示每個PCR反應管內熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數,ΔCT=目的基因Ct值-內參基因Ct值,mRNA表達量與ΔCt值呈反比關系)。

1.4統計學分析:使用SPSS20.0統計軟件進行t及χ2檢驗。

2 結果

2.1SOCS1、CKLF1 擴增產物的鑒定:在PCR的擴增曲線中每條反應管的擴增曲線拐點清楚,標準的基線平直或略微下降,無明顯的上揚趨勢,平行性好,表明其擴增效率相近,試驗重復性好。

2.2FCDD組與對照組外周血SOCS1、CKLF1的表達:FCDD患者 SOCS1、CKLF1 mRNA的ΔCT 值均小于對照組,二者差異有統計學意義(P均<0.05),ΔCT 值與 mRNA表達量呈反比關系,因此FCDD組外周血中SOCS1、CKLF1 mRNA的表達量明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);患者SOCS1、CKLF1 mRNA的表達經祛風清熱涼血方治療2 w時較治療前、治療4 w時較治療2 w時明顯降低,且差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 FCDD患者與正常對照組及祛風清熱涼血方治療2 w、4 w時SOCS1、CKLF1相對表達量的比較

2.3祛風清熱涼血方治療對SOCS1、CKLF1 mRNA表達的影響:2 w時與治療前、治療4 w時與治療2 w比較,SOCS1、CKLF1 mRNA均顯著下降,且差異均有統計學意義(P均<0.05),見表1。

2.4祛風清熱涼血方治療FCDD患者4 w時和2 w時療效比較:祛風清熱涼血方對FCDD有較好的治療作用,并且遠期療效更佳。見表2。

表2 祛風清熱涼血方治療FCDD患者4 w時和2 w時療效比較[n(%)]

3 討論

近年來Th細胞比例失衡在激素依賴性皮炎發生中的作用引起了眾多學者關注,而研究人員大多認為FCDD屬變態反應類疾病,Th細胞分化失衡可能是FCDD發病基礎[4]。SOCS1通過作用于JAK/STAT信號途徑在抑制Thl細胞增殖的同時促進Th2細胞分化[5],在Th1/Th2分化失衡所引發的各種變態反應性疾病中起重要作用。研究發現SOCS1表達的增高是調節Th1和Th2相互平衡的重要機制,體外實驗證實SOCS1在Th1細胞表達是在Th2細胞的5倍[6],這提示SOCS1可能參與了Th1/Th2分化的調節并且與免疫紊亂導致的疾病有關。有研究顯示,IL-6 可以通過活化STAT3上調CD4+T細胞SOCS1的表達,高表達的SOCS1對IFN-γ的分泌抑制,說明SOCS1主要是抑制IFN-γ介導的信號途徑,從而對 Th1 細胞分化起到抑制,引起以Th2占優勢的Th1/Th2免疫失衡[7]。研究發現SOCS1可以通過抑制IFN-γ而促進Th17細胞的分化[8]。綜上SOCS1可能是通過抑制IFN-γ/STAT1信號通路調節Th17細胞增殖,同時對Th1細胞分化起到抑制,引起以Th2占優勢的免疫失衡。本研究發現SOCS1在FCDD患者外周血中表達水平增高,表明SOCS1可能參與了FCDD的發病過程,而目前并無對SOCS1在FCDD患者中的報道。

CKLF1是趨化因子家族的一員,對淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞等有廣譜趨化活性,并促進炎性反應效應,參與免疫介導的炎性反應性疾病病理過程[9]。研究發現CCR4與其配體CKLF1的結合趨使Th2細胞從血液移至皮膚組織使Th1/Th2細胞亞群失衡[10],而IL-4水平表達升高時SOCS1又可以通過干擾IFN-γ信號誘導的STAT1磷酸化過程,抑制Th1細胞分化[11],從而達到協同作用,與本研究得出的SOCS1與CKLF1 mRNA的表達量呈正相關一致,但差異無統計學意義,可能與樣本含量有關。也有學者發現過敏性鼻炎患者鼻黏膜CKLF1與CCR4表達量較正常人明顯增高,CKLF1的表達與Th2細胞呈顯著正相關,同時CKLF1表達與鼻腔分泌物涂片及下鼻甲黏膜刮片嗜酸性粒細胞計數也呈顯著正相關性,說明CKLF1可能在變應性鼻炎嗜酸性粒細胞與Th2細胞的活化及浸潤中起到了重要作用,使過敏性鼻炎患者鼻黏膜局部CD4+T淋巴細胞主要向Th2分化,出現以Th2細胞表達升高而導致的Th2與Th1比例失調[12]。本研究顯示,推測CKLF1可能通過與Th2細胞表面的CCR4受體結合,使Th2細胞過度趨集活化導致Th1/Th2失調,同時CKLF1可能通過嗜酸性粒細胞表面的CCR4或其他受體,參與其嗜酸性粒細胞活化從而影響FCDD的發病,而目前并無對CKLF1在FCDD患者中的報道。

祛風清熱涼血方主要作用于熱毒熾盛證的FCDD患者,中醫認為激素類藥物藥性多屬辛溫、燥熱之品,長期外用可導致藥物毒邪侵犯肌膚,久之郁而化熱,使顏面部血熱瘀毒,故面部出現紅斑、毛細血管擴張、灼熱、瘙癢、皮膚變薄等。本研究結果表明推測祛風清熱涼血方可能通過抑制SOCS1,CKLF1的表達,影響Th17、Th2的分化進而調控體內Th1/Th2/Th17細胞亞群功能的平衡狀態,在FCDD中起到免疫調節作用。Th17細胞主要分泌的促炎因子IL-17可以促進嗜酸性粒細胞浸潤,同時對Th2免疫應答具有正調節作用,祛風清熱涼血方可能通過下調SOCS1的高表達提高Th1細胞的表達,減少Th17細胞分泌 IL-17,在一定程度上減弱對Th2細胞的正調控作用,從而糾正Th細胞亞群失衡,另一方面祛風清熱涼血方可能抑制了CCR4與其配體CKLF1結合的相互作用而產生抗炎效應,調節Th2細胞的過度趨集活化恢復Th1/Th2平衡,減輕了FCDD的炎性反應,發揮免疫抑制作用。通過對各單味藥的現代藥理研究,本方的作用可能為抗炎、抑制過敏、調節免疫反應,但中醫學強調整體觀念研究問題,祛風清熱涼血方療效確切,但其治療作用并非是通過對各單味藥物的藥理作用疊加而成,其具體作用機制還未明了,有待進一步研究[13-15]。