響應面試驗優化柿子皮多糖鉻的制備工藝研究

苗旭忠 李秀芬 高艷艷 張雪 張禧慶 喬魯芹

摘要：利用熱水浸提法提取柿子皮多糖，并將柿子皮多糖與三價鉻離子結合制備柿子皮多糖鉻。以鉻吸附率為指標，通過單因素和響應面法優化得到柿子皮多糖鉻的最佳吸附工藝。結果顯示柿子皮多糖鉻的最佳工藝為：柿子皮多糖與氯化鉻質量比6.7∶1.0，反應時間150 min，溫度82 ℃，吸附液pH為5，此時氯化鉻吸附率達92.81%。研究表明，柿子皮多糖可以高效結合三價鉻離子，為研發綠色無污染的鉻吸附劑或動物營養補充劑提供技術支持。

關鍵詞：柿子皮；多糖；鉻吸附；響應面試驗

中圖分類號：TS201.4?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1002-4026（2024）02-0127-08

Optimization of preparation of persimmon peel polysaccharide chromium

using response surface methodology

Abstract∶In this study， the hot water extraction method was utilized to extract polysaccharides from persimmon peel， and the persimmon peel polysaccharides were combined with trivalent chromium ions to prepare persimmon peel polysaccharide chromium. Considering the adsorption rate of chromium as the index， the adsorption process of persimmon peel polysaccharide chromium was optimized using single factor and response surface methodology. The results showed that the optimal preparation process of persimmon peel polysaccharide chromium consisted of the following steps， such as the mass ratio of persimmon peel polysaccharides to chromium chloride was set at 6.7∶1; the reaction time was 150 min; the temperature was set at 82 ℃; and the pH of the adsorption liquid was fixed at 5. Under these conditions， the maximum adsorption rate reached 92.81%. Therefore， this study has shown that persimmon peel polysaccharides can efficiently bind trivalent chromium ions， which can further provide technical support for the development of green pollution-free heavy-adsorption chromium adsorbents or animal nutritional supplements.

Key words∶persimmon peel; polysaccharide; chromium adsorption rate; response surface methodology

三價鉻是動物和人類糖脂代謝過程的必要元素，適量食用可在機體內發揮降血糖作用，加速葡萄糖的利用，改善胰島素的抵抗[1]。然而機體過量攝入鉻元素有致癌風險，且土壤中過量的三價鉻也會危害作物的生長[2-3]，目前我國存在水體、土壤鉻金屬污染情況，其中東江流域表層土壤中鉻的質量分數平均值為45.72 mg/kg，黃河流域沉積物中鉻的質量分數平均值為90.31 mg/kg[4-5]。當前處理鉻離子的物理化學技術包括離子交換、膜分離、化學沉淀和吸附法[6]。吸附法由于操作方便和適應性強而受到歡迎[7-8]，但使用強堿、酸或螯合劑吸附鉻離子會導致二次污染[9-10]。因此，有必要建立一種安全有效、可持續的鉻離子吸附方法。天然多糖聚合物富含活性官能團（如羧基、羥基、氨基），展現出較大吸附鉻離子的潛力，其可通過配位或靜電相互作用實現金屬離子的快速吸附，且來源豐富、成本低，具有可持續性、無毒性和可降解等優點[11]。

柿子作為經濟作物在中國被廣泛種植，在柿子加工過程中至少產生10%的柿子皮[12]，柿子皮富含多糖、多酚和單寧[13]。柿子皮多糖、多羥基和多羧基位點的特性使其具有高效吸附鉻離子的能力，提取的柿子皮多糖可作為鉻的吸附劑，可以解決柿子皮腐敗造成的環境污染問題，同時提高其附加值。目前，已見報道的多糖鉻研究涉及的多糖來源包括甜玉米芯[14]、山藥[15]、南瓜皮[16]、苦瓜[17]、萬年青[18]、黑木耳[19]、黃芪[20]和海藻[21]等，關于柿子皮多糖與鉻復合工藝的研究尚未見報道。

本研究利用柿子皮多糖結合氯化鉻制備柿子皮多糖鉻，采用響應面法優化柿子皮多糖鉻的制備工藝，并研究金屬鉻的吸附率，以期開發綠色鉻吸附劑或柿子皮多糖鉻動物營養補充劑，為柿子皮等農業副產物綜合利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent7800電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）（美國安捷倫科技公司）；SECURA224-ICN電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；S210 pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DKZ-2B水浴恒溫振蕩器（上海一恒科技儀器有限公司）；FD-304冷凍干燥機（濟南駿德儀器有限公司）。

1.2 材料

干制柿子皮（濰坊青州）；氯化鉻（分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）；鹽酸（優級純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；硝酸（優級純，蘇州晶瑞化學股份有限公司）；透析袋（截留分子量500 Da，怡康科貿生物試劑耗材試驗有限公司）。

2 方法

2.1 柿子皮多糖的提取

采用熱水浸提法提取柿子皮多糖[22]。取1 kg新鮮柿子皮，以1∶10的料液比加入去離子水，100 ℃下熱水浸提兩次，過濾收集濾液，濃縮后用4倍體積的無水乙醇醇沉，過夜靜置后，4 000 r/min下離心15 min，收集沉淀得柿子皮粗多糖。用熱水復溶柿子皮粗多糖，然后利用Sevage溶液（氯仿：正丁醇體積比為4∶1配置）除蛋白，重復操作7～8次至無蛋白層，去除有機溶劑后將多糖溶液濃縮并再次醇沉，4 000 r/min下離心15 min，冷凍干燥得到柿子皮多糖。

2.2 柿子皮多糖鉻的制備工藝

將柿子皮多糖與三價鉻離子復合制備柿子皮多糖鉻[23]。配制0.2 g/L的柿子皮多糖，與一定濃度的氯化鉻溶液等體積混合，調節多糖與氯化鉻質量比（g/g，下稱質量比）、吸附時間、吸附溫度和吸附液pH后于恒溫水浴振蕩反應，反應結束后，加入4倍體積的無水乙醇過夜醇沉，4 000 r/min離心15 min，上清液保存備用，沉淀復溶后用500 Da的透析袋透析72 h，冷凍干燥得到柿子皮多糖鉻。

2.3 單因素試驗

在柿子皮多糖與氯化鉻質量比為8：1，吸附時間為90 min，吸附溫度為55 ℃，吸附液自然pH條件下（pH為4～5）條件下，按2.2 節進行操作。其他條件不變，設置質量比為4：1、8：1、12：1、16：1、20：1，考察質量比對吸附率的影響；設置吸附時間為90、120、150、180、210 min，考察吸附時間對吸附率的影響；設置吸附溫度為45、55、65、75、85 ℃，考察吸附溫度對吸附率的影響；設置吸附液pH為3、4、5、6、7，考察吸附液pH對吸附率的影響。

2.4 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以柿子皮多糖吸附鉻的吸附率為響應值，以柿子皮多糖與氯化鉻質量比、吸附時間、吸附溫度和吸附液pH為自變量，進行4因素3水平響應面試驗。采用Design Expert 8.0統計分析軟件建立Box-Behnken模型，對吸附反應進行響應面優化設計。響應面試驗設計因素與水平見表1。每組試驗均重復3次，采用Design Expert 8.0.6進行數據統計分析，采用Origin 2017軟件繪圖。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

多糖與氯化鉻質量比對吸附率的影響見圖1（a）。結果表明，隨著多糖含量的增加，吸附率先升高后降低，當質量比為8：1時，吸附率達到最高值為87.57%。這種變化可能是因為柿子皮多糖分子中的結合位點完全被鉻離子占據，柿子皮多糖不能吸附溶液中剩余鉻離子，導致吸附率下降[24]，此外多糖分子與金屬離子間的靜電相互作用也會導致鉻含量的降低[25]。故選擇多糖與氯化鉻質量比4：1、8：1、12：1進行后續試驗。

吸附時間對吸附率的影響見圖1（b）。隨著吸附時間增加，吸附率先升高后降低，當吸附時間為150 min時，吸附率達到最大值為95.79%，繼續延長吸附時間，吸附率反而降低。多糖和鉻的結合在短時間內不穩定、不均勻，但時間過長會產生其他不必要的副產物，導致吸附率緩慢下降[26]。因此，選擇時間120、150、180 min進行后續試驗。

吸附溫度對吸附率的影響見圖1（c）?？梢钥闯鑫綔囟葘ξ铰实挠绊戄^小，隨著溫度的升高，吸附率不斷增加，但增加速率先快后慢，當溫度為75 ℃時，吸附率增速最快，吸附率達96.20%。這可能是由于多糖空間結構的變化以及多糖和鉻之間劇烈的分子運動引起的[27]。因此，選擇吸附溫度65、75、85 ℃進行后續試驗。

吸附液pH對吸附率的影響見圖1（d）。當pH為3時，吸附率較低，這可能是由于強酸性條件不利于鉻離子與多糖鏈上的—OH結合和多糖結構的穩定[26]，此后吸附率隨吸附液pH的增加而升高，在pH為5時吸附率達到最大值為92.0%，可能是由于多糖在弱酸性環境中發生自催化反應從而產生更多的羥基[28]，促進了多糖與鉻離子的結合。當pH為6時，吸附率降低，此后再增大pH，吸附率趨于穩定，這與Lu等[24]的研究結果相似，因此，選擇吸附液pH為4、5、6時進行后續試驗。

3.2 響應面試驗結果

3.2.1 響應模型的建立與分析

響應面試驗結果見OSID附表，方差分析結果見表2。對試驗數據進行回歸分析，得到吸附率（Y）對柿子皮多糖-氯化鉻質量比（A）、吸附時間（B）、吸附溫度（C）和吸附液pH（D）的四元二次擬合回歸方程為：

Y=89.23-8.37A+0.36B+4.23C-7.77D+2.22AB+1.09AC-5.81AD+0.69BC+1.01BD-1.10CD-9.70A2-6.28B2-2.97C2-15.05D2。（1）

由表2可知該模型差異性顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），說明此模型的擬合度較好；決定系數R2為0.983 1，說明吸附率的試驗值和模擬回歸值具有很好的一致性；校正后決定系數R2Adj為0.966 1，說明該回歸方程可信度較高，能夠反映96.61%的響應值變化。因此該模型的可信度和擬合度均較高，可以利用該模型對柿子皮多糖鉻的吸附能力進行預測和分析。

回歸模擬一次項A、C、D，交互項AD，二次項A2、B2、C2、D2對吸附作用影響顯著（P＜0.000 1），一次項B，交互項AB、AC、BC、BD和CD對吸附作用影響不顯著，可將其從回歸模型中刪除。最終確定回歸模型為：

Y=89.23-8.37A+4.23C-7.77D-5.81AD-9.70A2-6.28B2-2.97C2-15.05D2。（2）

因此，各因素對響應面的影響并不是簡單的線性關系，F值可以反映出各個因素對吸附率的影響程度[29]。本實驗中吸附率的影響因素從大到小排序為多糖與氯化鉻質量比、吸附液pH、吸附溫度、吸附時間。

3.2.2 響應面圖分析

由圖2（a）可知，質量比與吸附時間兩因素有一定的交互作用，質量比對響應值的影響程度大于吸附時間。隨著質量比和吸附時間的增加，吸附率先增大后減小。當吸附時間為150 min時，反應基本完成，過長的吸附時間并不會顯著提高響應值，反而可能會因水分的蒸發而導致吸附率下降。所以當質量比為6.7：1.0，吸附時間為150 min時，吸附率達到最大值。

由圖2（b）可知，質量比與吸附溫度兩因素交互作用不顯著，對吸附率的影響作用較小。質量比對響應值的影響大于吸附溫度。隨著質量比和吸附溫度的增加，吸附率逐漸增大然后減小。當溫度過高時，柿子皮多糖鉻的穩定性降低，部分吸附產物分解導致吸附率降低，不利于柿子皮多糖-鉻的合成。所以當質量比為6.7：1.0，吸附溫度為82 ℃時，吸附率達到最大值。

由圖2（c）可知，柿子皮多糖-鉻質量比與吸附液pH兩因素交互作用較強，由方差分析結果可知，兩因素間交互作用對吸附率影響較顯著。柿子皮多糖-鉻質量比對響應值的影響大于吸附液pH。隨著柿子皮多糖質量和pH的增加，吸附率逐漸增大然后減小。柿子皮多糖含量過高不利于多糖-鉻的生成，因為柿子皮多糖含量過高，使其溶解度下降，導致吸附率下降。pH大于或小于5都不利于吸附反應的進行，pH較小時，游離的H+與鉻離子競爭多糖上的結合位點；pH較大時，部分鉻離子的溶解度下降，導致吸附率下降。所以當柿子皮多糖-鉻質量比為6.7：1.0，pH為5時，吸附率達到最大值。

由圖2（d）可知，吸附時間和吸附溫度兩因素交互作用不顯著，對吸附率的影響作用較小。吸附溫度對響應值的影響大于吸附時間。隨著吸附時間延長和吸附溫度升高，吸附率逐漸增大然后減小。這與吸附過程中水分的蒸發以及多糖-鉻的穩定性有關。所以當吸附時間為150 min，吸附溫度為82 ℃時，吸附率達到最大值。

由圖2（e）可知，吸附時間與吸附液pH兩因素交互作用不顯著，對吸附率的影響作用較小。吸附液pH對響應值的影響大于吸附時間。隨著吸附時間延長和吸附液pH增大，吸附率逐漸增大然后減小，這與吸附過程中水分的蒸發有關。當吸附時間為150 min，pH為5時，吸附率達到最大值。

由圖2（f）可知，吸附溫度與吸附液pH兩因素交互作用不顯著，對吸附率的影響作用較小。吸附液pH對響應值的影響大于吸附溫度。隨著吸附溫度和吸附液pH的增大，吸附率逐漸增大然后減小。所以當吸附溫度為82 ℃，pH為5時，吸附率達到最大值。

綜合圖2可知，柿子皮多糖-鉻質量比和吸附液pH對吸附率的影響最為顯著，吸附時間和吸附溫度對吸附率的影響相對較小，柿子皮多糖-鉻質量比和吸附液pH過高或過低都會導致吸附率降低，這與回歸模型方差分析結果一致，說明模型顯著可行。

3.2.3 回歸模型驗證

結合Design Expert 8.0.6軟件分析可得最佳的吸附條件為：柿子皮多糖-氯化鉻質量比為6.69：1.0，吸附時間為149.71 min，吸附溫度為81.93 ℃，吸附液pH為4.78時，吸附率達到最大值為92.92%。為考慮實際生產需要，選擇以下條件進行驗證：柿子皮多糖-氯化鉻質量比為6.7：1.0，吸附時間150 min，吸附溫度82 ℃，吸附液pH為5時，在此條件下實際得到的柿子皮鉻多糖吸附率約為92.81%，與預測值相差較小為0.11%，說明該工藝穩定可靠，可用于生產。

4 結論

在柿子皮鉻多糖的制備過程中，各因素對吸附率的影響大小排序為：柿子皮鉻多糖與氯化鉻質量比、吸附液pH、吸附溫度、吸附時間。通過響應面法優化后得到最佳制備工藝為：質量比為6.7：1.0，吸附時間150 min，吸附溫度82 ℃，吸附液pH為5，在此條件下制備的柿子皮鉻多糖吸附率約為92.81%。本試驗為重金屬吸附劑或動物營養補充劑提供了理論依據，提高了柿子資源的綜合利用。

參考文獻：

［1］ZHANG Y Y， LUO J X， ZHU T T， et al. Dietary chromium could improve growth， antioxidant capacity， chromium accumulation in tissues and expression of genes involved into glucose and lipid metabolism in juvenile mud crab Scylla paramamosain[J]. Aquaculture Reports， 2022， 23： 101088. DOI： 10.1016/j.aqrep.2022.101088.

[2]徐國豪， 劉英豪， 常明慧， 等. 土壤外源鉻的作物毒性響應及富集差異研究[J]. 農業環境科學學報， 2023， 42（2）： 284-290. DOI： 10.11654/jaes.2022-0659.

[3]KUMAR V， PARIHAR R D， SHARMA A， et al. Global evaluation of heavy metal content in surface water bodies： a meta-analysis using heavy metal pollution indices and multivariate statistical analyses[J]. Chemosphere， 2019， 236： 124364. DOI： 10.1016/j.chemosphere.2019.124364.

[4]黃志偉， 李文靜， 李偉杰， 等. 東江流域土壤重金屬污染特征及潛在風險評價[J]. 農業環境科學學報， 2022， 41（3）： 504-515. DOI： 10.11654/jaes.2021-1291.

[5]李瑩， 李家科， 解偉峰， 等. 黃河流域沉積物重金屬污染評估及源解析[J]. 環境科學與技術， 2022， 45（7）： 96-104. DOI： 10.19672/j.cnki.1003-6504.0145.22.338.

[6]CHAI W S， CHEUN J Y， KUMAR P S， et al. A review on conventional and novel materials towards heavy metal adsorption in wastewater treatment application[J]. Journal of Cleaner Production， 2021， 296： 126589. DOI： 10.1016/j.jclepro.2021. 126589.

[7]GUAN X Y， CHEN Y， FAN H J. Stepwise deprotonation of magnetite-supported Gallic acid modulates oxidation state and adsorption-assisted translocation of hexavalent chromium[J]. ACS Applied Materials & Interfaces， 2017， 9（18）： 15525-15532. DOI： 10.1021/acsami.7b03061.

[8]WANG W， NI J M， CHEN L C， et al. Synthesis of carboxymethyl cellulose-chitosan-montmorillonite nanosheets composite hydrogel for dye effluent remediation[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2020， 165： 1-10. DOI： 10.1016/j.ijbiomac.2020.09.154.

[9]LIU G J， CUI CC， JIANG L， et al. Visible light-induced hydrogels towards reversible adsorption and desorption based on trivalent chromium in aqueous solution[J]. Reactive and Functional Polymers， 2021， 163： 104886. DOI： 10.1016/j.reactfunctpolym.2021.104886.

[10]JIANG C L， WANG X H， HOU B X， et al. Construction of a lignosulfonate-lysine hydrogel for the adsorption of heavy metal ions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2020， 68（10）： 3050-3060. DOI： 10.1021/acs.jafc.9b07540.

[11]GUAN X Y， ZHANG B Y， LI D P， et al. Remediation and resource utilization of chromium（III）-containing tannery effluent based on chitosan-sodium alginate hydrogel[J]. Carbohydrate Polymers， 2022， 284： 119179. DOI： 10.1016/j.carbpol.2022.119179.

[12]YE H F， LUO L， WANG J， et al. Highlygalloylated and A-type prodelphinidins and procyanidins in persimmon （Diospyros kaki L.） peel[J]. Food Chemistry， 2022， 378： 131972. DOI： 10.1016/j.foodchem.2021.131972.

[13]CUI Y L， CHEN Y J， WANG S， et al. Purification， structural characterization and antioxidant activities of two neutral polysaccharides from persimmon peel[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2023， 225： 241-254. DOI： 10.1016/j.ijbiomac.2022.10.257.

[14]修偉業， 王鑫， 李雨蒙， 等. 甜玉米芯多糖鉻配合物的制備、結構表征及體外活性的研究[J]. 食品工業科技， 2023， 44（13）： 186-196. DOI： 10.13386/j.issn1002-0306.2022080338.

[15]李燕平， 李宇翔. 一種山藥多糖與鉻絡合的方法及表征分析[J]. 海峽藥學， 2022， 34（7）： 5-8. DOI： 10.3969/j.issn.1006-3765.2022.07.002.

[16]張雯， 張禧慶， 董淑君， 等. 南瓜皮多糖鉻的制備與體外消化的分析[J]. 食品工業科技， 2022， 43（17）： 223-229. DOI： 10.13386/j.issn1002-0306.2021110329.

[17]張聰. 苦瓜多糖鉻絡合物制備及其降血糖活性研究[D]. 沈陽： 沈陽農業大學， 2019.

[18]秦月. 虎眼萬年青多糖及其鉻復合物降血糖作用的研究[D]. 哈爾濱： 黑龍江中醫藥大學， 2018.

[19]尹紅力， 王振宇， 梁薇薇， 等. 響應面法優化黑木耳多糖與三價鉻螯合工藝[J]. 安徽農業科學， 2014， 42（15）： 4830-4833. DOI： 10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.15.082.

[20]鄧毅， 尹龍萍， 趙愛華， 等. 黃芪多糖鉻絡合物的合成及其降血糖活性的初步研究[J]. 食品科學， 2007， 28（6）： 317-320. DOI： 10.3321/j.issn： 1002-6630.2007.06.077.

[21]張磊， 曹毓， 彭龍玲， 等. 海藻多糖鉻絡合物降糖作用的實驗研究[J]. 四川生理科學雜志， 2002（02）： 69-71. DOI： 10.3969/j.issn.1671-3885.2002.02.008.

[22]孔倩， 周婷， 武改蘭， 等. 南瓜水溶性多糖的制備及硫酸酯化初步研究[J]. 食品科學， 2009， 30（16）： 73-77. DOI： 10.3321/j.issn： 1002-6630.2009.16.010.

[23]ZHANG W， LI L Y， MA Y， et al. Structural characterization and hypoglycemic activity of a novel pumpkin peel polysaccharide-chromium（III） complex[J]. Foods， 2022， 11（13）： 1821. DOI： 10.3390/foods11131821.

[24]LI L， XU J X， CAO Y J， et al. Preparation of Ganoderma lucidum polysaccharide？偉cchromium （III） complex and its hypoglycemic and hypolipidemic activities in high-fat and high-fructose diet-induced pre-diabetic mice[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2019， 140： 782-793. DOI： 10.1016/j.ijbiomac.2019.08.072.

[25]CHI Y Z， LI Y P， ZHANG G L， et al.Effect of extraction techniques on properties of polysaccharides from Enteromorpha prolifera and their applicability in iron chelation[J]. Carbohydrate Polymers， 2018， 181： 616-623. DOI： 10.1016/j.carbpol.2017.11.104.

[26]BAI X Y， QIU Z C， ZHENG Z J， et al. Preparation and characterization of garlic polysaccharide-Zn （II） complexes and their bioactivities as a zinc supplement in Zn-deficient mice[J]. Food Chemistry： X， 2022， 15： 100361. DOI： 10.1016/j.fochx.2022.100361.

[27]LU Q， XU L， MENG Y B， et al. Preparation and characterization of a novel Astragalus membranaceus polysaccharide-iron （III） complex[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2016， 93： 208-216. DOI： 10.1016/j.ijbiomac.2016.08.049.

[28]CHAN T H， CHEN P T，CHANG H H， et al. Autocatalytic reaction in hydrolysis of difructose anhydride III[J]. The Journal of Physical Chemistry A， 2011， 115（37）： 10309-10314. DOI： 10.1021/jp206494r.

[29]呂俠影， 姜紹通， 余振宇， 等. 苦丁-荔枝復合飲料的研制[J]. 食品工業科技， 2015， 36（13）： 225-228. DOI： 10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.039.