基于血清藥物化學的烏蕨效用成分研究

黃斌　吳先昊　趙詩云　李雪　胡燕珍　張媛媛　陳樂

【摘 要】 目的：對烏蕨活性部位進行血清藥物化學研究，分析其體內入血成分。方法：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，通過對比浸膏、空白血清和含藥血清的圖譜差異，解析烏蕨活性部位浸膏經大鼠灌胃后血清中的原型成分和代謝產物。結果：從血清中鑒定了30個吸收入血成分，其中3個為原型成分，27個為代謝產物。結論：該研究較為全面的闡釋了烏蕨抗炎活性部位在大鼠血中的移行成分，為進一步研究其藥效物質基礎和作用機制奠定基礎。

【關鍵詞】 烏蕨；血清藥物化學；抗炎；UPLC-Q-TOF-MS/MS

【中圖分類號】R28 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）05-0055-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.05.zgmzmjyyzz202405011

Study on Effective Components of Stenoloma Chusanum Based on Serum Medicinal Chemistry

HUANG Bin，2 WU Xianhao ZHAO Shiyun LI Xue HU Yanzhen，2 ZHANG Yuanyuan，2 CHEN Le，2*

Abstract：Objective To study the serum medicinal chemistry of the active part of Stenoloma chusanum and analyze its blood entering components in vivo. Methods UPLC-Q-TOF-MS/MS technology was used to analyze the prototype components and metabolites in the serum of the active fraction extract of Stenoloma chusanum after intragastric administration in rats by comparing the differences in the chromatograms of the extract， blank serum， and medicated serum.Result 30 absorbed components were identified from the serum， of which 3 were prototype components and 27 were metabolites. Conclusion This study provides a comprehensive explanation of the migration components of the anti-inflammatory active site of the Stenoloma chusanum in rat blood， laying the foundation for further research on its pharmacological substance basis and mechanism of action.

Keywords：Stenoloma Chusanum; Serum Pharmacochemistry；Anti-inflammatory；UPLC-Q-TOF-MS/MS

烏蕨（Stenoloma chusanum Ching）又稱烏韭、苦黃連、大葉金花草等，為陵齒蕨科烏蕨屬多年生草本植物［1］。烏蕨中以黃酮類、有機酸類化合物為主要成分，研究表明烏蕨具有保肝、降血糖、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、解毒等作用［2-3］，《江西草藥》《中藥大辭典》《貴州中草藥名錄》、廣西中藥志》等都記載烏蕨用來治療痢疾、燙傷、支氣管炎、肝炎、黃疸等疾病。臨床上主要用于治療小兒細菌性或病毒性感染，如支氣管炎、肺炎、扁桃體炎及腸胃炎等疾?。?］。

文獻表明烏蕨乙酸乙酯部位提取物能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹［5］；本課題組前期對烏蕨抗炎活性篩選發現，烏蕨乙酸乙酯部位可顯著改善大鼠急性咽喉炎癥狀［6］，本實驗旨在研究烏蕨抗炎活性物質基礎，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析烏蕨乙酸乙酯部位血中移行成分，為進一步探討烏蕨抗炎機制通路奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AB-Sciex 5600系列LC/MS Trap型質譜儀，Waters C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），PeakView 1.2軟件；TDL-80-2B低速離心機、TCL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；XW-80A渦旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）。

1.2 材料 原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊素、木犀草苷、秦皮乙素、牡荊素葡萄糖苷（批號分別為110809-201906，110810-201608，111687-201704，11720-201106，741-200105，111979-201501，均購自中國食品藥品檢定研究院），葒草苷（批號：B20509，上海源葉生物科技有限公司）。健康雄性SPF級SD大鼠（180±20）g購于江西中醫藥大學，許可證號CCXK（贛）2018-0003。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 取烏蕨藥材1 kg，按料液比1∶15，用60%乙醇溶液回流提取3次，濃縮成浸膏，加適量水混懸，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，最后得乙酸乙酯部位浸膏31.2 g，加蒸餾水適量制備成生藥量為2 g/mL的混懸液，冷藏備用。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取各對照品適量，制備成濃度約為40 μg/mL的混合對照品溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 空白血清及含藥血清的制備 取雄性SD大鼠12只，隨機分為空白組和給藥組，每組6只，適應性飼養一周，實驗前禁食12 h，全程不禁水?？瞻捉M給予蒸餾水灌胃，給藥組均按20 g/kg生藥量進行灌胃給藥，早晚各一次，連續給藥3天，最后一次給藥后，分別于60 min、120 min、240 min，從大鼠股動脈放血，靜置30 min，離心10 min（4000 r/min），吸取上清液，即得血清供試品，于-80 ℃冰箱存儲備用。

2.4 含藥血清樣品的處理 各時間點分別取200 μL血清樣品并混合，得600 μL混合血清樣本，加入3倍量的乙腈，渦旋混合3 min，離心10 min（12000 r/min），取上清液，重復操作一次，上清液置EP管中，37 ℃水浴下氮氣吹干，殘渣用200 μL甲醇復溶，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.5 色譜條件 色譜柱為Waters C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，5%～30% A；20～25 min，30%～100% A；25～30 min，100%-100% A）柱溫為40 ℃，進樣量為2 μL，流速為0.25 mL/min。

2.6 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），掃描方式為負離子模式（ESI-，M/Z：100-1250 Da）；噴霧電壓（IS）為-4500 V，霧化氣溫度（TEM）為500 ℃，氣簾氣（CUR）為40.00 Psi，霧化氣（GS1）為50.00 Psi，輔助加熱氣（GS2）為50.00 Psi，去簇電壓（DP）為-100 V，碰撞能量（CE）為-40 V，碰撞能量疊加（CES）為15 V。

3 結果

通過UPLC-Q-TOF-MS/MS檢測，并經過與對照品、文獻相關數據比對，初步鑒定30種血中移行成分，其中3個為原型成分，27個為代謝產物，鑒定結果見表1，各樣品總離子流圖如圖1所示。

3.1 入血原型成分的解析 化合物2在負離子模式下其準分子離子峰為m/z 153［M-H］-，二級碎片m/z 109［M-H-CO2］-，m/z108 ［M-H-HCO2］-，與對照品及文獻［7］比對，鑒定為原兒茶酸?；衔?3在負離子模式下其準分子離子峰為m/z 179［M-H］-，二級碎片 m/z 135［M-H-CO2］-，m/z134 ［M-H-HCO2］-，與文獻［7］比對，鑒定為咖啡酸。

3.2 代謝產物的解析 原兒茶酸代謝途徑分析：化合物1在負離子模式下其準分子離子峰為m/z 233［M-H］-，二級碎片m/z 153［M-H-SO3］-，m/z 109［M-H-SO3-CO2］-；化合物3在負離子模式下其準分子離子峰為m/z 329［M-H］-，二級碎片m/z 153［M-H-GluA］-，m/z 109［M-H-GluA-CO2］-；化合物6在負離子模式下其準分子離子峰為m/z 247［M-H］-，二級碎片m/z 167［M-H-SO3］-，m/z 152［M-H-SO3-CH3］-，m/z 108［M-H-SO3-CH3-CO2］-；化合物7在負離子模式下其準分子離子峰為為m/z 189［M-H］-，二級碎片m/z 109［M-H-SO3］-，m/z 108［M-2H-SO3］-，m/z 153，m/z 109，m/z 108為原兒茶酸的特征碎片離子，結合參考文獻［8］，推測化合物1為原兒茶酸硫酸化產物，化合物3為原兒茶酸葡萄糖醛酸化產物，化合物6為原兒茶酸甲基化和硫酸化產物，化合物7為原兒茶酸脫羧后的硫酸化產物。代謝途徑如圖2所示。

木犀草素代謝途徑分析：化合物23在負離子模式下其準分子離子峰為m/z 637［M-H］-，二級碎片m/z 461［M-H-GluA］-，m/z 285［M-H-GluA-GluA］-；化合物25在負離子模式下其準分子離子峰為m/z 475［M-H］-，二級碎片m/z 299［M-H-GluA］-，m/z 284［M-H-GluA-CH3］-；化合物26在負離子模式下其準分子離子峰為m/z 541［M-H］-，二級碎片m/z 461［M-H-SO3］-，m/z 285［M-H-SO3-GluA］-。m/z 285為木犀草素的特征離子，結合參考文獻［9］，推測化合物23為木犀草素雙葡萄糖醛酸化產物，化合物25為木犀草素甲基化和葡萄糖醛酸化產物，化合物26為木犀草素硫酸化和葡萄糖醛酸化產物。代謝途徑如圖3所示。

4 討論

中藥成分復雜，不同成分的體內過程具有不同的藥動學特征，為了更全面表征烏蕨乙酸乙酯部位的血中移行成分，結合文獻［10-11］選擇將60 min、120 min、240 min的血清樣本混合進行分析；同時比較了乙腈和甲醇對血清樣本的除雜效果，發現乙腈沉淀效果明顯強于甲醇；目前對烏蕨質量控制的研究多以原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素、木犀草苷等為主要指標性成分，本次對烏蕨乙酸乙酯部位浸膏灌胃大鼠血清中移行成分研究中發現原兒茶酸、原兒茶醛、木犀草素相關代謝產物，未發現葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷原型成分及相關代謝產物，文獻［12-14］表明牡荊素等黃酮碳苷首過效應明顯，胃腸吸收弱，半衰期短，導致選取的目標時間點不合適。

本研究基于中藥血清藥物化學理論和UPLC-Q-TOF-MS/MS技術探討烏蕨乙酸乙酯部位浸膏灌胃大鼠血清中移行成分，共推斷了3個原型成分和27個代謝產物，以原兒茶酸、咖啡酸、香草酸、木犀草素代謝產物為主，其代謝類型主要是甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等二相代謝。同時可推斷原兒茶酸、木犀草素等為烏蕨主要抗炎藥效成分，與文獻資料相吻合，為研究烏蕨藥效物質基礎奠定基礎。

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（收稿日期：2023-06-01 編輯：杜玲玉珊）

基金項目：江西省中醫藥管理局科技計劃項目（2019A228）； 江西省中醫藥中青年骨干人才（第四批）培養計劃（贛中醫藥科教字［2020］6號）。

作者簡介：黃斌（1990—），男，漢族，碩士，助理研究員，研究方向為中藥分析。E-mail：3279844869@qq.com

通信作者：陳樂（1982—），女，漢族，碩士，研究員，研究方向為中藥分析。E-mail：76349830@qq.com