circRNA 經由 ceRNA 機制調控 BMSCs 成骨分化在股骨頭壞死中的研究進展

柳可心 劉凱 冬梅 王建忠

股骨頭壞死 ( osteonecrosis of the femoral head，ONFH )是骨科常見病和難治性疾病，發病機制為股骨頭血供受損或中斷引起股骨頭缺血、壞死，最終出現股骨頭塌陷、關節功能障礙等癥狀。研究調查顯示 ONFH 發病人數呈逐年上升趨勢，好發于 30～65 歲人群，并逐漸趨于年輕化，其中 30%～70% 的病例出現雙側股骨頭壞死，嚴重影響患者的生活[1]。按照病因 ONFH 主要分為創傷性股骨頭壞死( traumatic-induced osteonecrosis of femoral head，TIONFH )和非創傷性股骨頭壞死 ( non-traumatic osteonecrosis of the femoral head，NONFH )，前者主要由股骨頸骨折、髖關節脫位等外傷引起，后者在我國的常見原因為糖皮質激素和酒精的過量使用[2]。因 ONFH 早期癥狀不明顯，多表現為髖關節的疼痛，且 X 線片檢查對早期的細微骨質病變不敏感，所以很容易被忽視，往往錯過最佳治療時間。晚期的 ONFH 常伴隨股骨頭塌陷，人工髖關節置換術成為患者不可避免的選擇[3]。該病給患者帶來巨大經濟負擔和精神壓力，因此亟需確定新的診斷標志物以提高 ONFH 的早期檢出率，并為臨床靶向治療提供理論基礎。骨髓間充質干細胞 ( bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs )具有多方向分化為成骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞等的潛能，是髓腔內成骨細胞的主要來源[4]。研究表明，壞死的股骨頭中 BMSCs 的數量和成骨分化能力降低[5]，與ONFH 的進程有著密切關系。隨著高通量測序技術的發展，環狀 RNA ( circular RNA，circRNA ) 成為微小 RNA( microRNA，miRNA ) 及長鏈非編碼 RNA ( long noncoding RNA，LncRNA ) 后新的研究熱點。近年來，越來越多的研究證實 circRNA 主要通過競爭性內源 RNA ( competing endogenous RNA，ceRNA ) 機制調控 BMSCs 成骨 / 成脂分化，參與 ONFH 的發生發展[6]。因此，研究 circRNA 在BMSCs 成骨分化中的作用及其影響 ONFH 的發生發展機制，可以為 ONFH 的早期診斷和治療提供新的策略。

一、circRNA 概述和生物功能

circRNA 是一類廣泛存在于真核細胞中的非編碼RNA，主要存在于真核細胞的細胞質中，具有共價鍵首尾相連形成的閉合環狀結構[7]。與標準線性 RNA 不同，circRNA 不含 5’ 端帽子與 3’ 端多聚 A 尾結構，因此不受RNA 外切酶的影響，具有高穩定性，不易被降解[8]。起初circRNA 被認為是錯誤剪接或信使 RNA ( messenger RNA，mRNA ) 產生過程的副產物，隨著高通量測序技術和生物信息學研究方法的快速發展，在多種物種中發現大量的circRNA。多項研究發現 circRNA 是調控細胞分化、維持組織穩態等疾病生理病理過程中的重要參與者[9-11]。這表明circRNA 并非 mRNA 剪接的穩態副產物，而是一類在細胞中發揮重要作用的 RNA 分子，成為非編碼 RNA 領域的明星分子。根據 circRNA 的來源不同，可分為四類：( 1 ) 外顯子環狀 RNA ( exonic circRNA，EciRNA )；( 2 ) 內含子環狀 RNA ( intronic circRNA，ciRNA )；( 3 ) 外顯子 - 內含子環狀 RNA ( exon-intron circRNA，ElciRNA )；( 4 ) 來源于反義鏈轉錄本的反義環狀 RNA ( antisense circular RNA ) 以及基因間序列或其它未注釋基因組序列的環狀 RNA ( intergenic circular RNA )[12]。其中 EciRNA 占已知 circRNA 的 80% 以上，且比其它類型的 circRNA 更具序列保守型[13]。

1. miRNA 的分子海綿：miRNA 通過與靶基因中 3’ 端非翻譯區域 ( 3’UTR ) 結合抑制靶基因的翻譯，而 circRNA富含 miRNA 的結合位點，可以起到 miRNA 海綿的作用，通過直接與 miRNA 結合影響 miRNA 對靶基因 3’UTR 的結合，產生相應的生物學效應[14]。研究發現，circ_0015382在先兆子癇 ( pre-eclampsia，PE ) 胎盤組織中高表達，由于它能有效結合 miR-149-5p 而使 miR-149-5p 的活性下降，導致 miR-149-5p 靶基因的表達水平增加，進而抑制滋養層細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成，加快 PE 的進展[15]。Zhang 等[16]證實 circFCHO2 作為 miR-194-5p 的海綿通過 JAK1 / STAT3 途徑促進體內胃癌細胞的生長和肺轉移。此外，circRNA 通過 ceRNA 機制在多種疾病中發揮作用。

2. 作為翻譯模板：circRNA 雖然屬于非編碼 RNA，缺乏 5’ 端帽子與 3’ 端多聚 A 尾結構，但隨著對 circRNA研究的深入，發現有少數 circRNA 序列中含有開放閱讀框 ( open reading frame，ORF )、N6-甲基腺苷 ( N6-methyladenosine，m6A ) 修飾和內部核糖體進入位點( internal ribosome entry site，IRES )，能夠以不依賴帽子結構的方式進行翻譯[17]。目前，已經證實很多 circRNA 可以作為翻譯模板，為細胞提供生存所需的重要蛋白質。例如，circ-ZNF609 在肌肉形成過程中具有編碼蛋白的作用，并且熱應激 ( 2 h 44 ℃ ) 能使 circ-ZNF609 的翻譯能力增強[18]。Jiang 等[19]發現胃癌組織中環狀促分裂原活化蛋白激酶 1 ( mitogen-activated protein kinase 1，circMAPK1 )( hsa_circ_0004872 ) 相較于鄰近的正常組織表達水平下調，并證實其可通過編碼一種長度為 109 個氨基酸的新型蛋白質 MAPK1-109aa 抑制腫瘤的增殖和侵襲。circRNA 可作為翻譯模板的發現顛覆了以往只有 mRNA 才具有翻譯功能的認知，也進一步豐富了對人類基因組翻譯領域的研究。

3. 與蛋白質相互作用：circRNA 和蛋白質的相互作用對于 circRNA 的合成與降解及蛋白的表達與功能都會產生影響。RNA 結合蛋白 ( RNA binding protein，RBP ) 是一類與 RNA 的代謝加工相關的蛋白質，參與 RNA 的成熟、運輸、定位和翻譯[20]。circRNA 可以與特定的 RBP 結合，調節 RBP 與其靶 RNA 之間的相互作用[21]。人類抗原 R( human antigen R，HuR ) 是一種被廣泛研究的 RBP，研究發現 circAGO2 在胃癌[22]、結腸癌[23]、前列腺癌[24]和神經母細胞瘤[25]中上調，能夠與 HuR 蛋白結合并激活 HuR，促進 HuR 在靶基因的 3’UTR 富集，導致 argonaute 2 ( AGO2 )蛋白與靶基因的結合減少，進而抑制 AGO2 / miRNA 沉默復合體介導的基因沉默效應，加速癌癥進展[26]。細胞周期蛋白依賴性激酶 2 ( cyclin-dependent kinase 2，CDK2 ) 是一種絲氨酸 / 蘇氨酸 ( Ser / Thr ) 蛋白激酶，通常 CDK2 與細胞周期蛋白 A 和細胞周期蛋白 E 相互作用以促進細胞由 G1 期進入 S 期，是細胞周期轉變的必需物質[27-28]。Du 等[29]發現 circ-Foxo3 可與 CDK2 和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 p21 結合形成三元復合物，該復合物消耗了CDK2，阻止細胞由 G1 期進入 S 期，從而影響細胞周期進程和細胞增殖。

4. 參與轉錄調節：circRNA 主要以外顯子的形式存在于細胞質中，但其它類型 circRNA 具有的特性同樣值得一提。ciRNA 可與 RNA 聚合酶 Ⅱ ( polymerase Ⅱ，Pol Ⅱ ) 結合調節基因轉錄。Zhang 等[30]鑒定出 ci-ankrd52 作為 Pol Ⅱ的正調控因子進而促進親本基因表達。此外，ElciRNA 可與小核糖核蛋白 ( small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs )相互作用，再與 Pol Ⅱ 結合調節轉錄[31]。Li 等[32]發現ElciRNA，如 circEIF3J 和 circPIAP2，可與 snRNPs 相互作用促進親本基因的轉錄。

二、BMSCs 與 ONFH 的關系

Friedenstein 等[33]首次在骨髓中發現 BMSCs，其在特定誘導條件下可以發育為成骨細胞[34]、脂肪細胞[35]、軟骨細胞[36]、神經細胞[37]等。因其具有多向分化的潛力，在基因治療、組織工程、細胞替代治療和再生醫學等領域中已成為極其重要的種子細胞。

BMSCs 的成骨 / 成脂分化平衡在維持股骨頭的結構和功能的完整性中起著關鍵作用。在正常情況下，BMSCs 成骨分化和成脂分化能力處于動態平衡，當這一平衡遭到破壞，就會引起骨科疾病[38]。ONFH 患者 ONFH 區域成骨能力降低，相反成脂能力卻明顯增強[39]。隨著對 BMSCs 認知的不斷深化，BMSCs 為治療 ONFH 提供了新方向。例如，BMSCs 可以分泌細胞因子，通過旁分泌效應促進壞死區的血液供應[40]。Ma 等[41]在動物實驗中探討了血管內皮生長因子-165 ( vascular endothelial growth factor 165，VEGF-165 ) 與骨形態發生蛋白-2 ( bone morphogenetic protein 2，BMP-2 ) 基因修飾的 BMSCs 對 ONFH 的治療作用，結果表明 VEGF-165 / BMP-2 基因轉染可促進 BMSCs的成骨分化，有益于 ONFH 的修復。此外，利用各種物理手段如體外沖擊波[42]及化學藥物如淫羊藿苷[43]、丙戊酸[44]等可促進 BMSCs 成骨分化，在 ONFH 相關的臨床前實驗中取得較好的效果并逐漸應用于臨床。髓芯鉆孔減壓并自體 BMSCs 注射移植有效改善了患者骨髓腔內高壓引起的微循環障礙[45]。BMSCs 注射移植在治療早中期 ONFH取得較好療效，可降低股骨頭塌陷發生率[46]?？傊?，BMSCs 是 ONFH 發生發展的重要因素，在 ONFH 早中期以 BMSCs 為靶點對疾病進行干預，可以極大地改善患者預后。

三、circRNA 經由 ceRNA 機制調控 ONFH 中BMSCs 成骨分化

1. 促進 BMSCs 的成骨分化：circRNA 在細胞和組織中廣泛表達，Xiang 等[39]分析了從 ONFH 患者分離的 BMSCs中異常表達的 miRNA 和 circRNA，證實了 circRNA 可以通過 ceRNA 機制作用于相關信號通路介導 BMSCs 成骨、成脂分化來參與 ONFH 的進展。Hao 等[47]發現激素性股骨頭壞死 ( steroid-induced osteonecrosis of femoral head，SONFH ) 的大鼠股骨頭 BMSCs 中 circPVT1 表達水平降低而 miR-21-5p 上調。通過體內實驗證實：上調的 circPVT1通過 ceRNA 機制作為 miR-21-5p 的分子海綿，抑制miR-21-5p 與 Smad7 的 3’UTR 的結合，促進 BMSCs 成骨分化，通過 circPVT1-miR-21-5p-Smad7 / TGFβ 軸來影響SIONFH 的發展。Liu 等[48]發現 circ_AFF4 在 BMSCs 的成骨分化誘導過程中明顯增強，而 miR-135a-5p 的表達水平則顯著下降，下調 circ_AFF 能夠顯著抑制 BMSCs 的成骨分化潛能。使用生信分析預測 miR-135a-5p 為 circ_AFF4的潛在靶點，通過熒光素酶報告實驗和 RNA-pull down 實驗證實 circ_AFF4 作為 miR-135a-5p 的海綿，通過激活SMAD1 / 5 途徑誘導 BMSCs 的成骨分化。Xin 等[49]發現Circ_0066523 在 BMSCs 的成骨分化過程中過表達，通過體外實驗發現沉默 Circ_0066523 阻礙 BMSCs 的增殖和成骨分化。后續實驗證實了 circ_0066523 通過磷酸酶和張力蛋白同源物 ( phosphatase and tensin homolog，PTEN ) /磷脂酰肌醇 3 激酶 ( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K ) /蛋白激酶 B ( protein kinase B，PKB，又稱 AKT ) 途徑促進 BMSCs 的增殖和成骨分化?；?GEO 數據庫和實時熒光定量聚合酶鏈反應 ( real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR ) 測定，Chia 等[50]發現過表達的 circ-DAB1 ( has_circ_0113689 ) 會促進 BMSCs的增殖和成骨分化，而沉默 circ-DAB1 引起相反的功能。進一步實驗證明 circ-DAB1 通過 miR-1270 / miR-944 /RBPJ 途徑上調 DAB1 并促進 BMSCs 的細胞增殖和成骨分化。Huang 等[51]通過 RT-qPCR 發現 circ_0067680 在成骨分化過程中在 BMSCs 中過表達，敲低 circ_0067680 抑制 BMSCs 的成骨分化。進一步通過 RNA-pull down 實驗、RNA 免疫共沉淀 ( RNA immunoprecipitation，RIP ) 和熒光素酶報告基因分析證明，circ_0067680 作為 miR-4429 的海綿調節 CTNNB1 表達，從而通過激活經典的 Wnt / β-catenin信號通路促進 BMSCs 成骨分化。Xiang 等[39]為了研究 BMSCs 功能改變與 ONFH 之間的相關性，通過分析從 ONFH 患者分離的 BMSCs 中異常表達的 miRNA 和circRNA，并進一步探索 circRNA 在 ONFH 中作用的潛在調節機制。結果表明，hsa_circ_0000219 和 hsa_circ_0005936分別作為 miR-144-3p 和 miR-1270 的分子海綿，抑制其與靶基因 3’UTR 結合，促進 BMSCs 的成骨分化，進而延緩ONFH 的進展。

2. 抑制 BMSCs 的成骨分化：盡管許多 circRNA 在BMSCs 的成骨分化中起到了促進作用，但在持續的探索中，也發現許多可以抑制 BMSCs 成骨分化的 circRNA。Chen 等[52]在 SONFH 來源的 BMSCs 中檢測到 circRNA CDR1as 過表達。上調 CDR1as 會導致 BMSCs 成骨分化降低，脂肪分化增加。熒光素酶報告基因檢測證實 CDR1as和 WNT5B 的 miR-7-5p 結合位點，表明 circRNA CDR1as可能通過 CDR1as-miR-7-5p-WNT5B 軸在 BMSCs 的成骨 / 成脂分化中起關鍵作用。Kuang 等[53]在 SONFH 和TIONFH 患者的股骨頭組織中均檢測到 circUSP45 的表達水平上調，進一步實驗發現上調的 circUSP45 通過 ceRNA機制作為 miR-127-5p 分子海綿，進而抑制 miR-21-5p 與PTEN 的結合，通過抑制 AKT 信號通路來抑制 BMSCs 的成骨分化，影響 ONFH 的進程。Zhang 等[54]對 TIONFH 血液樣本進行測序后發現眾多差異性表達的 circRNA，后續對 TIONFH 患者的 BMSCs 和破骨細胞樣細胞 ( osteoclastlike cell，OLC ) 進行監測，驗證了 circRNA_25487 作為miR-134-3p 的分子海綿，抑制了 miR-134-3p 與 p21 的結合從而抑制 BMSCs 成骨分化。Han 等[55]發現 circ_0058792相對于健康個體明顯上調，而 miR-181a-5p 則下調。沉默circ_0058792 和過表達 miR-181a-5p 后會顯著提高堿性磷酸酶活性和基質礦化能力。后續證實 circ_0058792 作為miR-181a-5p 的分子海綿，通過 TGF-β / Smad7 途徑來調節 BMSCs 的成骨分化。Feng 等[56]利用 circRNA 微陣列檢測 ONFH 的 BMSCs 中 circRNA 表達譜，進一步研究了上調最顯著的 circHGF 對 BMSCs 的增殖和成骨分化的影響。實驗證實 circHGF 通過 ceRNA 機制與 miR-25-3p 結合，抑制 miR-25-3p 與靶基因 SMAD7 的 3’UTR 結合，抑制了BMSCs 的增殖和成骨分化。以上 circRNA 經由 ceRNA 機制對 BMSCs 成骨分化的調控作用見表1。

四、臨床價值

1. 疾病診斷：早診早治 ONFH 是延緩股骨頭塌陷及改善預后的重要舉措。大多數 circRNA 在不同物種間序列具有高度保守性，且在不同組織和發育階段選擇性表達，在血清和組織中具有高穩定性。因此，circRNA 有作為反映疾病診斷和預后的潛在生物標志物的潛力。Jiang 等[57]使用 RT-qPCR 檢測了 NONFH 患者血漿和局部 circCDR1as 的表達水平。結果與健康對照組相比后發現 NONFH 患者的血漿 circCDR1as 表達顯著增高，局部壞死組織中的 circCDR1as 顯著高于鄰近的非受累組織。更重要的是 circCDR1as 的表達水平與疾病的嚴重程度呈正相關：與 ARCO 1 / 2 期相比，ARCO 3 期患者的血漿和局部 circCDR1as 表達明顯上調；同樣，與 ARCO 3 期相比，ARCO 4 期患者的血漿和局部 circCDR1as 表達明顯上調。通過接收者操作特征 ( receiver operating characteristic，ROC ) 曲線分析表明，血漿中 circCDR1as 的表達水平可作為 NONFH 患者疾病嚴重程度的良好評價指標。相信未來可通過抽取血液、穿刺局部樣本或利用基因芯片技術快速篩查異常表達的 circRNA，為 ONFH 的早期診斷、病情監測提供有效的數據支持。

2. 疾病治療：由于 ONFH 的后期致殘率高，股骨頭塌陷疼痛，關節功能障礙，嚴重影響患者生活質量，晚期多需要進行人工髖關節置換術。雖然手術治療有較好的效果，但創傷大、費用高、患者恢復周期較長等問題很大程度限制了手術的治療方式。以特定 circRNA 為靶點的精準醫療成為研究熱點。孫含瑞[58]證明 circRNA-25487 表達水平的高低與 TIONFH 患者和股骨頸骨折未壞死患者的BMSCs 成骨增殖、分化能力均呈負相關。通過茜素紅染色、堿性磷酸酶 ( alkaline phosphatase，ALP ) 染色發現，補腎活血藥可以調節 circRNA-25487 的基因表達水平，進而調控 BMSCs 的成骨分化能力。該研究為 BMSCs 成骨能力的調控機制提供有力實驗依據，為臨床早期防治 ONFH 提供新的方法。在未來，相信通過調控特定 circRNA 的表達以促進 BMSCs 成骨分化會為治療 ONFH 提供更多可能。

五、總結和展望

ONFH 的發病機制復雜，致殘率高，并逐漸趨于年輕化，所以早期診斷、治療尤為重要。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展與成熟，已有大量研究表明，circRNA經由 ceRNA 機制介導 TGF-β / SMAD、PI3K / AKT、NOTCH和 Wnt / β-catenin 等信號通路調控 BMSCs 成骨分化在ONFH 病程發展中發揮重要作用。目前，circRNA 相關研究尚處于起步階段，研究方向集中于 ceRNA 調控網絡。在未來，circRNA 與蛋白結合、作為翻譯模板、調控基因轉錄等功能是否存在于 ONFH 的發生發展中有待深入探究。此外，需要更多的基礎研究和臨床試驗去探尋circRNA 調控 BMSCs 的成骨分化以外的調控 ONFH 的相關機制，如影響成骨細胞和破骨細胞的活性、血管內皮細胞損傷和軟骨細胞的分化等。隨著研究的深入，ONFH 的早期防治、診斷和治療有望提升到分子水平，或可通過基因芯片快速篩查異常表達的 circRNA，提高 ONFH 早期檢出率，并以 circRNA 為靶點為 ONFH 的早期診斷和治療提供新的視角。