組合化學的高通量合成策略

段梅莉

【摘 要】本文對一門新興的用于新藥開發的組合化學技術進行了簡要的歸納和總結。組合化學的高通量合成策略從合成方法學上歸納為三類方法:平行合成法、裂分合成法、集組式合成。并概括介紹了高通量合成的重要輔助因子固相載體技術和自動化技術。

【關鍵詞】組合化學 高通量合成 新藥開發

【中途分類號】O621.3 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-8209(2009)11-0-03

20世紀80年代末興起的組合化學技術在新藥開發的過程中,在先導物的發現和結構優化上取得了卓有成效的研發結果。組合化學所運用的高通量合成技術與傳統的有機合成有顯著的不同。如圖1所示,一般有機合成方法每次合成得到一個產物。高通量合成技術則是進行組合合成,用一個構建模塊A與另一個構建模塊B的n個單元同時進行一步反應,可以得到n個產物。用一個構建模塊A的m個單元與另一個構建模塊B的n個單元同時進行一步反應,則得到m×n個化合物;若進行Y步反應,則得到n×n×Y或m×n×Y個化合物。有人作過統計,一個化學家用組合合成在2～6周完成的工作量,相當于十個化學家用傳統方法花費一年時間才能合成得到的化合物數目。由此可見,高通量合成大幅度提高了新化合物的合成效率,減少了時間和資金的消耗,成為繼20世紀末至今化學研究的一個熱點。

高通量合成可以分為固相組合合成和液相組合合成兩大類,組合化合物庫也相應的分類為固相庫和液相庫。因此庫化合物的合成策略應當圍繞著這二大類組合合成展開進行。高通量合成從合成方法學上來說,可歸納為以下三種方式:平行合成法;裂分合成法;集組式合成。

1 平行合成法(Parallel synthesis)

也稱間隔平行式合成。間隔平行式合成的基本原理是一孔一化合物。與傳統有機合成的原理相似,通過空間隔開的整齊排列的反應器皿來平行合成化合物。由于在特定區域可得到很純的化合物,因此化合物結構測定容易,參數相對容易取得。該方法的特點是合成速度較快、化合物數目較大,可用于固相組合合成和液相組合合成中。平行合成法多使用96孔微量滴定板操作。平行合成法已成功用于抗菌化合物和神經激肽-2拮抗劑類似物等化合物庫的制備。

當化合物庫有許多生物活性化合物供篩選時,使用平行合成法最適合。因為平行合成法合成的化合物是一孔一化合物,單個化合物對新藥開發中先導化合物優化和構效關系研究(SAR)特別有價值。平行液相合成和平行固相合成均可快速、高效的合成出對應大量單個化合物的液相庫和固相庫。固相庫的合成產量可以從納摩爾到毫摩爾不等,一般來說液相庫的產量較固相庫高?；衔飵烊萘吭趲浊б陨蠒r,多采用自動化裝置進行合成。

1.1 多針法(Polypin)

也稱多中心合成法,它是Geyson教授發明的用于多肽合成的一種96孔微量滴定板反應裝置。該裝置每孔對應使用長40mm,直徑4mm的聚乙烯小棒(針)固定在滴定板上進行操作。每個小棒承載的化合物量在100納摩爾-50微摩爾不等,可合成超過25mg的產物。這種多針合成反應裝置已成功地用于口蹄疫病毒抗原體的免疫學研究上。

多針合成法的具體操作是,將浸在丙烯酸水溶液中的聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)小棒用γ射線照射,使針的表面活化?；罨蟮尼槺霍然采w。這些羧基與長鏈的結合分子連接后,就提供了既能增加反應體系流動性又可以連接構件的氨基基團。把不同的氨基酸溶液反應試劑移到96孔微板的每個孔中,即可對每一根針進行獨立的合成反應。在每步反應完成后將小棒移開,在一個公共反應器中對這些小棒同時進行樹脂珠的沖洗等純化操作。重復這些操作直至拿到理想化合物。對應小棒上的目標產物可通過切割分離到滴定板的每個孔中,就使得每個孔均含有一個單獨的化合物。使用連在針上的多肽進行生物活性測定時,可與多種靶分子進行結合試驗,操作可反復進行多達幾十次。

多針合成法是一種有效平行合成多肽的方法,尤其是以羧基或酰胺結尾的多肽。該法也可用以合成苯并二氮雜窧類有機小分子化合物庫。目前該技術正向著高負載量、多種官能團化的固相載體材料以及多樣性豐富的化學反應方向發展。在先期為抗原位點研究進行的多肽合成中,多針合成法產生了非常大的影響,已成為最有價值的組合化學合成技術的標志。

1.2 茶葉袋法(Tea-bag)

茶葉袋法是Houghten教授1986年發明的一種組合合成技術。該技術自使用以來,對探明激素分子活性片段有關的構效關系研究、對蛋白質片斷構象的探察以及對RGD肽類似物的深入研究都顯示了很大的功效。

該方法的固相載體為常見的Merrifield聚苯乙烯樹脂,反應容器為化學惰性的多孔PE小袋,袋子的大小尺寸約為15mm×22mm,茶葉袋網眼74um,可防止樹脂珠漏出,保證溶劑等可溶性物質的出入。為了高通量合成大容量的多肽庫,節省時間和工作量,在相同的化學反應步驟中,每一個反應器內可容納多個袋子,同時進行相同的反應,集中進行洗滌、脫保護和中和。再集中切除樹脂珠。根據茶葉袋的尺寸和樹脂珠的質量,化合物庫每個產物的產量大約為7-15mg,多的可達100mg。使用這種集中進行共同反應步驟的方法,在制備肽庫時大大提高了合成效率,使之成為組合合成的典型范例。

1.3 點陣法

該法是以纖維素紙片作為固相載體的合成技術。以纖維素為基質的紙片具有多孔性和極性,可在篩選時避免出現非特異性蛋白結合的副作用。但其缺點是不耐受強酸環境,僅適合Fmoc保護方式的構件。該合成反應操作簡便,雖無制備意義,但其合成技巧可以與嫁接多針掃描法及超大規模固定化多肽合成技術相媲美。點陣法多肽庫的合成已用于對人體巨細胞病毒蛋白抗原決定簇的定位試驗。

點陣法斑點合成技術操作是,控制所用試劑的體積,選擇斑點的位置,使斑點布滿一張紙面而又不發生重疊。這些斑點對應不同的多肽,可以用鉛筆標記斑點。將結合分子接到紙上后,對每個斑點滴加相應高濃度的氨基酸活化酯溶液,經洗滌-脫保護-再洗滌處理,完成一個構件的縮合。如此反復操作進行多肽的合成。用溴酚藍指示劑給紙片染色,通過觀察由藍到黃的顏色變化(游離的氨基被?；?來跟蹤反應進程。

1.4 光印法(Light-directed parallel synthesis)

也稱超大規模固定化多肽合成(very large scale immobilized peptide synthesis, VLSIPS)。光印法是將固相合成技術與光敏式印刷技術結合為一體的一種高通量合成方法。它是平行合成中較為特殊的一種方法,其關鍵技術是對光不穩定的保護基通過特殊位置的光照會選擇性的斷裂。該法可以在一張50um2的玻璃載片上合成出容量高達5萬的多肽或寡聚核苷酸的化合物庫。并且每種特定產物序列占據空間的一個特定區域。由于篩選是連在載體上進行,經熒光顯色篩選識別出有生物活性化合物的結構,可由其所在位置得到確認,合成十分精確。該合成技術已用于內啡肽的抗體合成篩選試驗。

2 裂分合成法(split-poll synthesis)

亦稱混合-裂分式合成、一珠一化合物(one-bead one-product, OBOP)。裂分合成法是最早也是至今應用最廣泛的一種高通量組合合成技術。該法只需幾個反應器即可構成一個容量龐大的化合物庫,是合成大量不同化合物最常用的方法。裂分合成技術為藥物先導化合物的發現提供了充足的化合物資源,改變了傳統的單一合成/單一篩選的藥物研究格局。

裂分合成法只需幾個反應器就可以產生一個化合物庫,圖2例示了三個構建單元通過三步反應的裂分合成。具體操作是,將固相載體樹脂珠分成數目相等的三部分,每一部分放在單獨的反應器中,各部分獨自與不同的構建單元A、B和C反應,這樣每一個樹脂珠就連接上了一個構建單元。當第一步反應完成后,將每個反應器中的樹脂珠分成數目相等的三部分,并混合每一個反應器中的樹脂珠成均等的三部分,爾后集中在一個器皿中進行常規的沖洗和脫保護程序。然后將每一部分樹脂珠放在單獨反應器中獨自與不同的構建單元A、B和C反應,這樣每一個樹脂珠就連接上了第二個構建單元。如此反復直至庫容量達到了33=27個化合物。

裂分合成法合成的特點是OBOP,即每一個樹脂珠都連有一個單獨的化合物。因此,該法的組合化合物庫又稱為一珠一化合物庫。裂分合成法制得的化合物庫中產物的數目以幾何級數增長,N=bx(N為庫容量;b為構建單元數;x為合成步驟數)。

用高效的編碼技術輔助進行裂分合成時,可以幾個小圓柱形反應器為混分操作的基礎單元,每一個反應器由微孔外壁將幾百粒樹脂珠和射頻記錄片包在其中,在合成反應進行的同時輸入該構件單元的射頻信號。因此合成完成后,通過解讀記錄片上的信號即可識別反應器內連在樹脂珠上的產物結構信息。每一個反應器內的所有樹脂珠上均連著同一產物,這樣得到的化合物庫稱其為一反應器一化合物庫,即OVOP(one-vessel one-product)庫。

裂分合成法合成的庫化合物的生物活性篩選可以直接用樹脂珠上的化合物測試活性,更可靠的方法是用固相載體上切下的混合物溶液來測試。解纏繞過程是常用的一種對混合裂分合成化合物庫進行生物活性篩選的方法和手段。

3 集組式合成(pooling synthesis)

也稱混合試劑合成法。集組式合成的特點是對全部構件進行有序排列并按一定形式編組。每一組含有多種不同的構件,一組作為一種構建單元投入合成。庫化合物組合合成的每一步反應都是在構建單元混合物的反應器皿中進行。固相集組式合成得到的不是一珠一化合物庫,而是一珠一組甚至是一珠多組化合物庫。液相集組式合成得到的化合物庫,可以按組分布,每一組均含多種化合物。不管是固相庫合成還是液相庫合成,兩者都需要高效的編碼技術輔助進行,以備在其后的生物篩選中它們的結構信息得到及時的識別。

集組式合成可歸納為正交編組法、索引編組法以及模板核心法三種形式的操作過程。集組式合成是發現藥物先導化合物最經濟的方法。該方法實驗設備要求低,不必逐一合成組合庫中各個單組分,一般的實驗室即能進行合成操作。雖然該法簡易可行,但缺點也明顯,即組分越多,分析跟蹤及產物結構識別的難度越大。

4 固相載體技術

固相合成技術是高通量合成的核心內容,該技術從20世紀60年代被Merrifield創造性地成功合成多肽以來,便得到了極大的重視。在國際醫藥企業的合力運作下,1990年代至今固相合成技術得到了蓬勃發展,基本形成了固相有機合成化學的獨立學科。而且固相合成技術遠未成熟,被認為仍有極大的發展空間,現在的成果只是金山一角。有統計表明,與有機化學相關的排名前15位的國際期刊幾乎每一期均刊登與固相有機合成相關的論文。固相合成技術最基本的構成要素就是固相載體。因此固相載體技術可以說是固相庫合成的基石。

4.1 功能樹脂

固相載體是在各種溶劑中不溶解但可溶漲的高聚物材料,即功能樹脂。高通量合成要求載體具有一定的化學穩定性和機械強度;能夠與結合分子相連,但對庫合成中使用的反應條件惰性,在需要時隨時方便斷開;能夠在結合分子上延續化合物的制備,延續的合成步驟不破壞載體,也不影響其它化學鍵。

隨著高分子材料的發展,基于交聯聚苯乙烯(PS)的高強度Merrifield樹脂、在極性非質子溶劑中溶解度高,官能團保護、脫保護和切割條件更加溫和的聚酰胺樹脂以及可在水相中進行合成、對酶學研究意義重大的TentaGel(PS-PEG copolymer)樹脂等各類功能性樹脂材料被先后開發出來。任何功能樹脂均可以按合成的要求制成固相載體。固相載體從外形上可以分為樹脂珠、多針和薄片。

4.2 樹脂珠技術(bio-bead)

絕大多數的固相庫合成是通過樹脂珠技術來實施的。1g樹脂可以制成幾百萬個樹脂珠,按照“三倍多余”的原則,可以構建一個10萬個產物的化合物庫。每個樹脂珠的直徑大約為100?m,可承載200pmol的化合物。樹脂珠的制備方法是,向單體有機相和交聯劑的混合水溶液中加入自由基引發劑,升溫啟動聚合反應,將微小液滴轉變為固體球狀小珠子顆粒。其聚合反應的要點是保證小珠體積均一。運用平行合成法、裂分合成法進行的組合合成均可得到每一個樹脂珠都連有一個單獨化合物的一珠一化合物庫,即OBOP(one-bead one-product)庫。

4.3 薄片技術(thin tag)

任何一種能在樹脂珠上進行的化學反應均能在薄片上實施合成反應。用PS樹脂制成的形似小餅干的薄片(chip),如四邊形、三角形、圓形、五角形和六角形的小薄片,它們有一定的強度和許多微孔,且有良好的溶脹性。由于較大的表面積,產物的上載量遠遠大于一粒樹脂珠,因此較有制備意義。運用裂分合成法組合合成可得到每片薄片上有一種產物的化合物庫,即OCOP(one-chip one-product)庫。

基于紙片的薄片可作為點陣法平行合成的載體。而基于玻片的薄片可作為光印法平行合成的載體。

4.4 固相膜技術

基于高聚物的薄片比紙片的化學性質更穩定,因而可以承受更寬的化學反應條件范圍。聚氟乙烯膜制成的高聚物薄片的點合成,其合成方法與紙片斑點技術相似,將膜表面用乙二胺衍生化后,便提供了帶有氨基的活化基團表面。將有Fmoc保護的丙氨酸活化酯溶液以規則的空間排布方式點到固相膜上,就得到了用于多肽合成的斑點。在點合成偶聯步驟之間,膜可被多次晾干-洗滌-再晾干,用哌啶溶液脫Fmoc保護,多肽的多種產物就集合在一張薄片上。

還有一種固相膜三明治合成技術,是將兩張PP小片夾住樹脂珠,像三明治一樣,用一種低熔點的聚合物使珠子在膜操作及整個合成步驟中固定不動。運用裂分合成法組合合成可得到每張層狀載片上有一種產物的化合物庫,即OSOP(one-slide one-product)庫。由于每一張層狀載片上含有許多樹脂珠(可達幾千粒),則每一種產物的量相對較高,因此OSOP庫合成具有制備意義,比OBOP庫合成實用性高。

5 自動化合成技術

隨著生物化學技術的高速發展,每天可篩選上萬個化合物生物活性的高通量篩選技術已經被廣泛運用。當組合化合物庫容量達到上千的規模時,在有限的時間里,完成人工合成和對生物靶點的篩選是一項十分艱巨的工作。因此庫化合物的自動化高通量合成技術便應運而生,可以說這是為了跟上高通量篩選的步伐,而產生的一種快速、高效的合成技術。與該技術相配合,需要機器來完成的操作有,樹脂珠裝載、試劑的轉移、合成條件的控制、合成反應的進行、化合物的分離、純化和結構分析以及樹脂珠的切割等。顯然自動化高通量合成技術是一項繁雜有序的過程工程,它將有機化學、計算機技術以及信息和電氣自動化技術等多學科集于一體。

組合化學需要合成大量毫克級量的化合物來篩選。該特點使得利用高效小型機件和器械來處理大量樣品,成為節約省時最基本的前提。固相庫的平行合成法組合合成是自動化高通量合成技術取得成功運營的一個范例。滴定機器人等自動化機件被廣泛的使用在許多合成操作上。已知多肽和核酸的組合合成,目前已經完全可以用自動平行合成儀來進行操作。但是自動化高通量合成技術水平仍然低于發展較為完善的高通量篩選。平行合成自動儀每天約產生1000～2000個化合物,而微量滴定板上的高通量篩選,可對特定的生物受體每天篩選1～5萬個化合物。

絕大多數的高通量合成是在10mg、10-20umol數量級的微反應系統內進行。微反應器的普遍使用給組合合成和篩選策略帶來了根本的改變。微反應器聯通了合成和篩選的直接整合,也提供了發現新藥化合物的更好方法。微反應器與微尺度純化和高靈敏度分析設備緊密相連,毫微托板用于從微流量分離單元中直接收集樣品,直接轉移到生物分析單元。這樣整合的成套設備,使化合物合成后就用來篩選,設備中沒有儲存系統。

6 結束語

以上對新興的用于新藥開發的組合化學技術進行了簡要的歸納和總結。組合化學的高通量合成策略從合成方法學上可以歸納為三類方法:平行合成法、裂分合成法、集組式合成。本文還概括介紹了高通量合成的重要輔助因子固相載體技術和自動化技術。相信在不久的將來,最早用于新藥開發的高通量合成技術在我國相關的研發領域能得到較大的普及應用。

參考文獻

[1] 吉民.組合化學,北京:化學工業出版社,2004.

[2] 王德心.固相有機合成,北京:化學工業出版社,2004.

[3] 王德心..組合化學原理、技術及應用,北京中國協和醫科大學出版社,2005.

[4] Willi Bannwarth, et al, Combinatorial Chemistry, Weinheim, WILEY-V.