X-性染色體連鎖凋亡抑制蛋白與口腔鱗癌細胞Tca8113化療耐藥的關系

王家鳳 張志民 王成坤 聶代邦 高文信

（1.吉林大學口腔醫院 牙體牙髓病科，吉林 長春 130021；2.吉林大學農學部 動物技術系，吉林 長春 130062）

X-性染色體連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）參與了多種惡性腫瘤的增殖與轉化，其表達水平與腫瘤的發生、預后以及化療耐藥密切相關[1]?？谇击[狀細胞癌是頜面部常見的腫瘤之一，本研究旨在探討XIAP在人口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達水平，并分析XIAP表達與Tca8113細胞化療耐藥之間的關系，為腫瘤的治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料來源

人舌鱗癌細胞系Tca8113細胞（由中國科學院上海細胞所提供），IMDM培養基、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑（長春寶泰克公司），平陽霉素（Pingyangmycin，PYM）（吉林大學口腔醫院藥房），逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain raction，RT-PCR）試劑盒、PCR-marker、DNA回收試劑盒、T載體（Takara公司，日本），XIAP引物合成送至長春寶泰克公司完成。

1.2 細胞的培養和處理方法

在37℃、5%CO2培養箱中，使用含10%新生牛血清的IMDM培養液培養Tca8113細胞。取對數生長期Tca8113細胞，培養液中加入PYM，使其終濃度為0.5 μg·mL-1，用該藥物作用72 h，棄去含PYM的培養液，再用正常培養液沖洗3次，然后加入新鮮正常培養液培養72 h，待細胞恢復正常生長，重復上述步驟1次后，將藥物濃度提高1倍進入下1個培養周期。重復以上步驟，直到Tca8113細胞能夠維持在藥物濃度分別為1、10 μg·mL-1的培養液中正常生長，而成為耐藥Tca8113細胞，命名為Tca8113-1、Tca8113-10。耐藥細胞模型建立后，將這2種細胞在各自的藥物濃度下分別培養10、20 d，分別為Tca8113-1-10組、Tca8113-1-20組、Tca8113-10-10組、Tca8113-10-20組。

1.3 MTT法檢測細胞對PYM的敏感性

將Tca8113-1-10組、Tca8113-1-20組、Tca8113-10-10組、Tca8113-10-20組和未加藥物處理的Tca8113組細胞分別以每孔1×104個接種于96孔板，各孔加入不同濃度的PYM培養基進行培養，濃度分別為1 000、100、10、1、0.1 μg·mL-1，每種濃度設3個復孔。3 d后每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μg，繼續培養6 h，吸干培養基，加入二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）150 μL，室溫搖床上混勻10 min后，在490 nm波長下測各孔的光密度值（A值）。實驗在相同條件下重復5次，將細胞密度的對數與細胞抑制率作半對數曲線，根據趨勢公式計算出藥物半數有效濃度（IC50）。

1.4 RT-PCR法檢測XIAP mRNA的表達水平

細胞RNA的抽提及逆轉錄按一步法RT-PCR試劑盒的說明書進行。XIAP的上游引物序列為：5′-AGAACAGAAGGGACAAGAATA-3′；下游引物序列為：5′-CACAAGGAACAAAAACGATAG-3′，擴增長度為524 bp。β-actin上游引物序列為：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′；下游引物序列為：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，擴增長度為204 bp。反應完畢后，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠分析系統分析并照相，用Quanity one圖像分析系統測光密度值進行半定量。實驗在相同條件下重復5次。1.4.1 PCR產物的檢測 PCR產物用2%水平瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后取出凝膠，進行光密度值掃描，得到XIAP各擴增帶光密度值和面積值，然后用其表達量與對應的β-actin表達量的比值進行比較。1.4.2 PCR產物的測序 PCR產物用2%水平瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后用刀片將擴增帶割下，按照DNA回收試劑盒的說明書將擴增后的DNA產物回收。將回收后的目的DNA連接至T載體上，按照T載體說明書標識的方法操作，送至長春寶泰克公司測序。

1.5 統計學分析

采用SPSS 10.0統計軟件對數據進行分析，所有計數資料的比較均采用方差分析，藥物與IC50相對量之間的關系采用直線相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測結果

在各濃度PYM作用下，各耐藥組細胞抑制率明顯低于Tca8113細胞組（P＜0.05），說明各耐藥組細胞對PYM有明顯抗藥性。Tca8113-1-10組、Tca8113-10-10組耐藥細胞對PYM的IC50分別為（12.758±0.030）、（18.986±0.150）μg·mL-1，二者與Tca8113細胞組IC50（6.414 μg·mL-1±0.059 μg·mL-1）比較差異有統計學意義（P＜0.05）。Tca8113-1-20組、Tca8113-10-20組耐藥細胞對PYM的IC50分別為（26.302±0.072）、（35.294±0.115）μg·mL-1，二者與Tca8113細胞組IC50比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 PCR產物的電泳結果

RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

圖 1 各組細胞的電泳結果Fig 1 The electrophoresis results of every group

圖像經分析系統分析，測得XIAP和β-actin的光密度值和面積值，計算Tca8113細胞組、Tca8113-1-10組、Tca8113-10-10組、Tca8113-1-20組、Tca8113-10-20組結果分別為0.324、0.401、0.695、0.898、1.096。結果表明，XIAP對細胞耐藥有影響，并且有濃度和時間依賴性，隨著藥物濃度和作用時間的增加，XIAP mRNA的表達增強，XIAP mRNA的表達水平與耐藥株耐藥時間呈明顯正相關（P＜0.01），Tca8113-10-20組表達最強。以XIAP mRNA的相對含量為自變量（X），IC50為因變量（Y），建立方程為：Y=-3.421+34.326X。統計結果表明XIAP的表達水平與Tca8113細胞對PYM的耐藥性呈正相關（P＜0.01）。

3 討論

細胞凋亡程序失調能導致許多疾病，包括腫瘤的發生和發展、抗藥、神經變性疾病、自身免疫性疾病，XIAP是參與細胞凋亡機制的主要因子[2]。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族是至今發現的哺乳類細胞中唯一的內源性半胱天冬酶（caspase）抑制物，能有效阻止細胞凋亡。研究發現，XIAP是IAP家族中對caspase抑制作用最強的成員，可通過多種途徑誘導細胞凋亡：XIAP通過N-端的3個BIR結構域抑制caspase-3、caspase-7和caspase-9活性，或通過C端的RING鋅指結構域催化caspase泛素化降解[3]。

目前頭頸部惡性腫瘤的治療方法仍是以外科手術配合化療和放療的綜合治療為主，而耐藥又是化療失敗的主要原因。探討腫瘤產生耐藥的原因、分子機制以及如何抵抗腫瘤的耐藥性以提高化療的效果和降低藥物的毒副作用是當前腫瘤治療領域急需解決的問題。XIAP在口腔鱗癌組織中呈高表達，XIAP可能與腫瘤的化療耐藥有關[4]。為此本研究選擇了可以被誘導產生耐藥性的Tca8113細胞為研究對象，采用了間歇性加藥、逐步遞增劑量、體外連續培養誘導其產生耐藥性[5]，并運用RT-PCR檢測不同耐藥劑量和時間誘導的Tca8113細胞中XIAP的表達水平。研究結果顯示在Tca8113細胞中XIAP呈高水平表達；Tca8113-1-10組、Tca8113-10-10組細胞的IC50有所升高，Tca8113-1-20組、Tca8113-10-20組細胞IC50升高明顯，這與馮戈等[6]的研究結果一致。

本研究結果顯示，隨著化療藥物培養時間的延長及藥物濃度的增加，細胞對化療藥物的耐藥性逐漸增加，同樣XIAP的表達水平也隨之增加，且與時間的關系最為密切；直線相關分析提示XIAP的表達水平與Tca8113細胞對PYM的耐藥性呈正相關。有研究[7-8]采用siRNA或反義寡核苷酸技術下調XIAP的表達后，腫瘤細胞恢復了對藥物的敏感性。因此，認為Tca8113細胞中XIAP表達水平的升高是在化療藥物的誘導下出現的，升高的XIAP進而參與了細胞繼發性耐藥性的產生，然而基因表達的調控機制是極其復雜的，XIAP在藥物作用下表達的變化具體機制有待進一步研究。

[1] Schimmer AD,Dalili S,Batey RA,et al.Targeting XIAP for the treatment of malignancy[J].Cell Death Differ,2006,13（2）：179-188.

[2] Dean EJ,Ranson M,Blackhall F,et al.X-linked inhibitor of apoptosis protein as a therapeutic target[J].Expert Opin Ther Targets,2007,11（11）：1459-1471.

[3] Rajcan-Separovic E,Liston P,Lefebvre C,et al.Assignment of human inhibitor of apoptosis protein（IAP） genes xiap,hiap-1,and hiap-2 to chromosomes Xq25 and 11q22-q23 by fluorescence in situ hybridization[J].Genomics,1996,37（3）：404-406.

[4] 菅志遠,李宜雄,李小剛,等.X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白在胰腺癌組織及細胞中的表達與化療耐藥的關系[J].中華消化雜志,2006,26（2）：816-820.JIAN Zhi-yuan,LI Yi-xiong,LI Xiao-gang,et al.Expression of X-linked inhibitor of apoptosis in pancreatic carcinoma tissues and its relationship to chemoresistance[J].Chin J Digestion,2006,26（2）：816-820.

[5] 張萍,王大章,鄭光勇,等.體外短期化療誘導Tca8113細胞株產生耐藥性的研究[J].華西口腔醫學雜志,2003,21（1）：70-73.ZHANG Ping,WANG Da-zhang,ZHENG Guang-yong,et al.Induction of multidrug resistance in Tca8113 cells by transient exposure to different chemotherapeutic drugs[J].West China J Stomatol,2003,21（1）：70-73.

[6] 馮戈,王大章,陳槐卿,等.體外誘導Tca8113細胞產生耐藥性的分析[J].華西口腔醫學雜志,2007,25（2）：184-187.FENG Ge,WANG Da-zhang,CHEN Huai-qing,et al.Induction of drug resistance in Tca8113 cell line by exposing to chemotherapy drug[J].West China J Stomatol,2007,25（2）：184-187.

[7] McManus DC,Lefebvre CA,Cherton-Horvat G,et al.Loss of XIAP protein expression by RNAi and antisense approaches sensitizes cancer cells to functionally diverse chemotherapeutics[J].Oncogene,2004,23（49）：8105-8117.

[8] Galbán S,Hwang C,Rumble JM,et al.Cytoprotective effects of IAPs revealed by a small molecule antagonist[J].Biochem J,2009,417（3）：765-771.