骨髓間充質干細胞復合多孔納米羥磷灰石/聚酰胺6整復大鼠顱骨缺損的實驗研究

高鶯 李繼華 李玉寶 左奕 胡靜 馬永清 王雪梅

（1.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學，四川 成都 610041；2.山西醫科大學第一醫院 口腔科,山西 太原 030001；3.四川大學 納米生物材料中心，四川 成都 610041）

組織工程化骨由種子細胞、生物支架材料2大元素構建而成，其發展克服了自體或同種異體骨移植等傳統骨缺損修復方法取材有限、并發癥多的弊端，為修復大面積骨缺損提供了全新思路，成為骨缺損治療新的突破點。種子細胞要求具有來源廣泛、易于接種存活、穩定性好等特點，更為重要的是細胞在特定環境下能夠實現快速擴增，并具有較強的成骨向分化能力[1－2]。而生物支架材料則不僅要起到支撐作用，維持原有組織外形，還需起到三維模板作用，為最初的細胞黏附、增殖和分化提供場所，并為隨后的受損組織再生提供引導[3－4]。本研究通過大鼠骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）與新型多孔納米羥磷灰石/聚酰胺6（nano－hydroxyapatite/polyamide 6，n－HA/PA6）復合體外培養，觀察支架材料對BMSCs增殖和骨向分化的影響；并運用此細胞—支架復合體修復SD大鼠顱骨極限缺損，以探討BMSCs作為種子細胞、n－HA/PA6多孔復合體作為生物支架材料構建組織工程化骨的骨缺損修復效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要試劑

健康成年SD大鼠，體重280～350 g,雌雄不限，由四川大學華西醫學中心實驗動物部提供。LGDMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，地塞米松、β－甘油磷酸鈉、維生素C、維生素D3均購自美國Sigma公司。

1.2 大鼠骨髓BMSCs的體外分離、培養

將SD大鼠處死，無菌條件下取其股骨、脛骨，剪去骨骺端，用注射器沖出骨髓，與含10%FBS的LG－DMEM培養基制成細胞懸液，在37℃、5%CO2的培養箱內貼壁培養，每2～3 d換液。當細胞70%～80%融合時，用0.25%胰酶消化，1∶2比例傳代。從第3代BMSCs開始，置于骨向誘導液中培養：含10%FBS的LG－DMEM、10 nmol·L－1地塞米松、10 mmol·L－1β－甘油磷酸鈉、0.05 mmol·L－1左旋抗壞血酸。培養過程中，每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況、形態變化，并照相記錄。

1.3 n－HA/PA6多孔支架材料的制備

n－HA/PA6由四川大學納米生物材料研究中心及分析測試中心提供，以NaCl為致孔劑，采用粒子瀝濾－相轉移法制備。該材料是三維多孔立體結構：孔徑50～300 μm，平均孔徑180 μm，大孔壁上存在豐富的微孔，孔徑約0.5～50 μm，孔隙率67%，且孔間相互貫通（圖1）。將制備好的n－HA/PA6切割成直徑8 mm、厚1 mm的小圓片，環氧乙烷消毒備用。

圖1 n－HA/PA6多孔仿生材料 SEM ×40Fig 1 Micrograph of n－HA/PA6 SEM × 40

1.4 礦化誘導的第3代BMSCs與n－HA/PA6多孔仿生材料復合培養

直徑為8 mm的圓形多孔n－HA/PA6薄片在礦化誘導液中浸泡24 h后，將礦化誘導10 d的第3代BMSCs滴加在材料表面，5%CO2、37℃孵箱中培養，隔天換液。在復合培養第1、3、5、7、9天時進行MTT比色法檢測細胞增殖：每孔加入MTT溶液40 μL，在37℃孵箱中孵化4 h后，棄上清并加入DMSO150 μL，在490 nm波長下測其光密度值。在復合培養1周時，用胰酶消化細胞，接種于蓋玻片上，24 h后進行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色：細胞爬片取出，PBS洗滌，多聚甲醛固定15 min，ALP孵育液孵育20 min，流水沖洗，醋酸溶液浸泡1 min，蒸餾水沖洗，甘油明膠封固。將MTT和ALP染色結果與單純礦化誘導的第3代同期BMSCs檢測結果進行比較，以觀察n－HA/PA6對BMSCs增殖、分化的影響。

1.5 種子細胞—支架材料復合體體內植入實驗

SD大鼠52只，體重280～350 g,隨機分為3組：1組植入n－HA/PA6與種子細胞復合體（24只），1組植入n－HA/PA6（24只），另設4只空白對照組（缺損區不植入任何材料）。將大鼠頂部備皮，10%水合氯醛（3.3 mL·kg－1）腹腔注射麻醉，無菌條件下頭頂皮膚作弧形切口，剝離暴露顱骨，用裂鉆制造直徑8 mm極量骨缺損,根據分組情況植入相應材料，縫合切口。術后第4、8、16周，BMSCs與n－HA/PA6復合組、單純n－HA/PA6材料組各處死8只動物獲取顱骨標本，空白對照組則僅在術后第16周獲取樣本，分別進行組織學、掃描電鏡檢測。

1.6 組織學檢查

福爾馬林固定7 d，EDTA脫鈣20 d，經石蠟包埋后，連續切取厚約5 μm的組織切片，進行蘇木精－伊紅染色，光學顯微鏡下觀察新骨形成情況。對BMSCs與n－HA/PA6復合組、單純n－HA/PA6材料組第4、8、16周切片采集圖像后進行計算機圖像分析，統計新生骨組織在骨缺損區所占的面積百分比。

1.7 掃描電鏡檢查

樣本依次經過PBS清洗、戊二醛固定、PBS清洗、鋨酸固定、50%～100%乙醇梯度脫水、醋酸異戊酯浸泡、臨界點干燥、表面噴金，觀察并拍照。

1.8 統計學方法

用SPSS 10.0軟件對數據進行統計學分析。組間比較采用t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT生長曲線

以時間為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制生長曲線（圖2），結果顯示：材料組與對照組之間細胞增殖差異無統計學意義（P＞0.05），提示n－HA/PA6對礦化誘導培養的BMSCs的生長和增殖無影響。

2.2 ALP染色

礦化誘導BMSCs復合n－HA/PA6培養1周后，所得細胞爬片ALP染色均為陽性，胞漿中可見紅黑色顆粒（圖3）。結果與單純礦化誘導培養的第3代BMSCs相同，說明n－HA/PA6支架材料對礦化誘導培養的第3代BMSCs的成骨細胞表征沒有影響。

2.3 組織學觀察

BMSCs復合n－HA/PA6組植入4周時，在植入體與原骨組織交界處可見較多成骨細胞，有新生骨小梁形成；8周時，植入體和天然骨組織界面可見較多向材料側延伸的新骨形成，較成熟，含有骨小梁，其內骨陷窩增多，周邊可見成骨細胞，但新骨礦化程度較天然骨低（圖4）。

圖2 材料組與對照組細胞MTT生長曲線Fig 2 MTT growth curves of BMSCs from n－HA/PA6 group and control group

圖3 礦化誘導的BMSCs復合n－HA/PA6培養1周后ALP陽性染色ALP染色 ×400Fig 3 ALP positive staining in the osteoblastic differentiated BMSCs seeded on the scaffolds of n－HA/PA6 for one week ALP staining ×400

圖4 BMSCs復合n－HA/PA6修復大鼠顱骨缺損Fig 4 The bone healing in calvarial defects after implantation of n－HA/PA6 seeded with BMSCs

16周時，材料和天然骨組織界面可見大量成熟新骨形成，并伸入材料的空隙內，形成骨性結合。與之相比，單純n－HA/PA6組4、8周時樣本顯示：植入體和原骨組織界面之間膠原纖維多一些，新生骨小梁少一些，成骨量亦少，且不成熟；16周時則與BMSCs復合n－HA/PA6組無明顯差別。

骨組織形態學測量顯示（表1）：修復性新骨的面積百分比隨時間而增長，4、8周時BMSCs復合n－HA/PA6組高于單純n－HA/PA6組（P＜0.05），16周時，2組間無顯著差異（P＞0.05）。

表1 不同組別術后4、8、16周骨缺損區新骨所占面積百分比（±s）Tab 1 Area percentage of the newly formed bone to the whole defect area in different groups after 4，8，16 weeks（±s）

表1 不同組別術后4、8、16周骨缺損區新骨所占面積百分比（±s）Tab 1 Area percentage of the newly formed bone to the whole defect area in different groups after 4，8，16 weeks（±s）

面積百分比/%4周 8周 16周BMSCs復合n－HA/PA6組 19.71±4.07 42.65±7.19 73.79±9.87單純n－HA/PA6組 10.69±2.59 21.31±5.74 62.61±8.43組別

2.4 掃描電鏡觀察

術后4周，BMSCs復合n－HA/PA6組在植入體和原骨組織界面大片散在網織狀骨，新骨組織融合成板層骨，而單純n－HA/PA6組在材料和原骨組織界面僅有少量新骨形成；術后8周，BMSCs復合n－HA/PA6組植入體表面完全被新骨組織覆蓋，界面達到骨性整合，而單純n－HA/PA6組植入體和原骨組織界面雖然新骨形成較4周時有所增加，但密度較低；術后16周，BMSCs復合n－HA/PA6組和單純n－HA/PA6組植入體界面和表面完全被新骨組織覆蓋（圖4）。

3 討論

理想的細胞外基質材料要求具備以下特性：適當的孔隙率、足夠的強度和韌性、良好的成形加工性能以及良好的生物和物理相容性[5]。然而單一組分或單一結構的材料往往難以同時滿足以上要求，這就需要將幾種材料進行適當組合，綜合其各自優勢，合成有機/無機，羥磷灰石/多聚體等復合生物材料[6]，更好地實現對缺損骨組織的修復。本研究中選用的n－HA/PA6多孔復合物，就是一種以NaCl為致孔劑，采用粒子瀝濾—相轉移法制備,由模擬自然骨的組成和結構的生物活性無機材料和有機高分子材料所形成的復合生物材料。n－HA微粒的直徑在10～20 nm，以納米尺度高比例均勻分布，可在40%～70%范圍內調配，其大孔孔徑分布在50～300 μm，平均孔徑約為180 μm，且大孔壁上存在豐富的微孔，孔間相互貫通，支架孔隙率約為77%[7]，與傳統的羥磷灰石陶瓷相比，具有更大的表面積，利于新生骨組織長入；而PA6分子中含有極性酰胺基團，分子末端分別是氨基和羧基，具有與骨組織膠原纖維相似的結構，與n－HA復合后能夠形成類似人自然骨的晶體—膠原復合結構，具有高度的仿生性能，有利于種子細胞的黏附，同時具有較好的抗壓性、耐磨性、耐熱性。

本研究中，首先培養出了符合骨組織工程種子細胞數量要求的高純度的具有成骨細胞表型的BMSCs，進一步復合n－HA/PA6體外培養，發現BMSCs生長良好，細胞生長曲線和單純培養BMSCs的生長曲線沒有差別，ALP染色亦為陽性。結果提示：n－HA/PA6具有良好的細胞相容性，對BMSCs生長、增殖和骨向分化均不產生影響。在此基礎上，本課題進行了整復SD大鼠顱骨極限缺損的實驗研究：術后16周空白對照組顱骨標本僅有少量骨質從缺損邊緣略向中間生長，仍有直徑6 mm以上的缺損，而BMSCs復合n－HA/PA6與單純n－HA/PA6多孔支架材料植入后，均無骨吸收、排斥現象，無骨髓炎、骨壞死發生，16周時植入體和原骨組織間的間隙完全消失，由新生骨組織充填，表明n－HA/PA6多孔仿生骨具有良好的組織相容性，其各級別的孔隙有利于血管、骨細胞的長入，從而誘導新骨生成。

與n－HA/PA6組主要通過骨傳導方式修復骨缺損不同，BMSCs復合n－HA/PA6組通過骨傳導、骨誘導[8]2種方式修復骨缺損，由于種子細胞的介入，在4、8周時骨修復效果優勢明顯，新骨形成更早、更多、更成熟，不僅宿主骨與n－HA/PA6之間有新骨形成，n－HA/PA6內部也有新骨形成，進一步證實了n－HA/PA6多孔材料作為一種理想的細胞外基質材料構建組織工程骨的優勢。因此，可以說以BMSCs為種子細胞、以n－HA/PA6為支架材料，構建組織工程化骨修復骨缺損，能夠有效促進骨愈合進程，縮短骨愈合時間，本研究為未來骨組織工程技術的發展和進行骨缺損的修復提供了一定的實驗依據。

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