成骨細胞中Runx2對機械離心力刺激的響應

關鍵 程宗生 王健平 李德超 鄧慧鑫

（佳木斯大學口腔醫院 口腔頜面外科，黑龍江 佳木斯 154004）

從Codivilla介紹牽張成骨術（distraction osteogenesis，DO）至今已有一百多年的歷史，但目前對牽引產生的機械力如何轉化為生物學信號的細胞和分子機制尚不清楚。骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）參與DO中新骨的生成并發揮重要作用[1-3]，其可能參與DO力學信號向生物信號轉化過程[4-5]。BMP信號轉導通路在成骨細胞對機械力刺激響應中的作用還不清楚，對該問題的研究將為DO外源性應用BMP提供理論基礎。本研究旨在通過生理狀態和阻斷BMP信號轉導通路時，在mRNA層面對比研究成骨細胞株MC3T3-E1中Runx2對機械離心力刺激的響應，從側面探討BMP信號轉導通路在成骨細胞對機械力刺激響應中的作用和意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

小鼠胚成骨細胞株MC3T3-E1（中國醫學科學院基礎所細胞中心），DMEM（GIBCO公司，美國），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），重組小鼠Noggin蛋白（Perpro Tech公司，美國），Trizol（上海生工公司），cDNA逆轉錄試劑盒、Power SYBRRGreen PCR試劑盒、ABI7300 PCR儀（ABI公司，美國），50 bp DNA Marker（TaKaRa公司，日本），細胞培養瓶/板（Coring公司，美國）。

1.2 MC3T3-E1細胞的培養

37℃、5%CO2、含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM培養基中培養MC3T3-E1細胞，隔天換液。當細胞鋪滿瓶底80%以上時，37℃下0.25%胰蛋白酶1.5 mL消化3～5 min，見瓶底出現針孔樣透明時，加入等量含10%FBS的DMEM培養基終止消化，吹打細胞制成細胞懸液，按1∶3傳代，第2天換液。

1.3 細胞加力

自制六孔細胞培養板離心支架，使之能將匹配的六孔板一起固定于LXJ-Ⅱ型離心沉淀機中離心，離心加力系統的剖面見圖1。根據公式：離心力（RCF）=1.118×10-5×R×V2計算離心力的大小，單位為重力加速度×g。離心半徑R約19 cm，轉速V約1 100 r·min-1，離心力約271×g。

圖1 離心加力系統的剖面圖Fig 1 Centrifugal profiles based augmentation systems

1.4 加力分組

將待測細胞隨機分為A、B、C、D組。A組為空白對照組，細胞未接受Noggin預處理和機械離心力加載；B組為細胞接受271×g離心力加載5 min；C組為細胞接受100 ng·mL-1Noggin預處理24 h；D組為細胞接受100 ng·mL-1Noggin預處理24 h和271×g離心力加載5 min，每組6孔。4組細胞同時種板，培養48 h后以無血清的DMEM繼續培養24 h，同步細胞周期。加力前24 h更換為含10%FBS的DMEM培養基，將六孔板無菌密封。30min后4組分別收獲細胞。

1.5 Runx2表達的檢測

按Trizol試劑說明提取細胞總RNA，并逆轉錄成cDNA。采用Power SYBR?Green染料法進行PCR，引物由Invitrogen公司合成，目的基因Runx2（Gene-Bank accession number NM_004348）上游引物序列為：5′-TCCAACCCACGAATGCACTAC-3′，下游引物序列為：5′-GTAGTGAGTGGTGGCGGACT-3′，擴增產物片段為92 bp；內參對照β-actin（GeneBank accession number NM_007393）上游引物序列為：5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′，下游引物序列為：5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′，擴增產物片段為171 bp。PCR反應條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s，62℃ 1 min，共40個循環。PCR產物同期進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 Runx2對離心力刺激的響應

MC3T3-E1細胞中Runx2 mRNA的檢測結果見圖2。由圖2可見，B組Runx2 mRNA表達較A組增加（P<0.05），離心力可使Runx2 mRNA表達增加。D組經Noggin預處理后比B組對離心力刺激時Runx2 mRNA表達降低（P<0.05），Noggin抑制Runx2 mRNA的表達。C組Runx2 mRNA表達無明顯變化，A、C、D組間差異無統計學意義（P=0.692）。

圖2 成骨細胞Runx2 mRNA的表達Fig 2 The expression of Runx2 mRNA in osteoblastic MC3T3-E1 cells

2.2 實時熒光定量PCR產物電泳分析

凝膠電泳結果顯示PCR產物雜帶少，RT-PCR產物純度較高（圖3）。

圖3 Runx2表達產物凝膠電泳圖Fig 3 The electrophoresis results of expression product of Runx2

3 討論

成骨細胞是骨組織內的力學敏感性細胞，同時它在骨改建過程中又處于一個中心調控的地位，是研究骨形成機制的基本單位[6-7]。MC3T3-E1細胞表型穩定，使其在對成骨細胞的各項研究中得到了廣泛地應用。目前對離體細胞有多種加力方式：低滲性膨脹、離心、單/雙向拉伸和流體剪切等，這些不同的離體應變使細胞產生不同的生理響應過程。本實驗的離心加力方式與Fitzgerald等[8]所提出的類似，離心力使貼壁生長的細胞受到一個頂—底軸向的壓力，避免了細胞懸浮離心時細胞之間以及細胞與基質之間附著狀態的喪失。Fitzgerald等[8]發現對MC3T3-E1細胞加載3×g的離心力相當于輕微力量，而287×g的離心力則相當于劇烈刺激的力量。前期實驗表明對MC3T3-E1細胞加載271×g的離心力5 min能有效刺激成骨細胞，并且離心力刺激強度在成骨細胞生理范圍之內。離心力在一定程度上反映成骨細胞受到機械力學刺激作用，但是無法完全模擬體內DO成骨細胞的實際受力情況。

成骨細胞對力學信號的轉導通過胞膜上Ca2+通道、胞外基質-整合素-細胞骨架結構系統[9]、細胞因子等多種途徑入核作用于靶基因Runx2并調控相應基因表達構成復雜的力學信息傳遞網絡。本研究結果顯示：與A組相比，B組Runx2 mRNA表達增加，可能為成骨細胞對機械離心力刺激響應的結果，驗證了Runx2作為力學信號靶分子參與了成骨細胞響應機械離心力刺激的生理過程。Ziros等[10]證實Runx2/Cbfa1蛋白及基因都是力學刺激的關鍵目標，認為Runx2/Cbfa1基因表達的增強是力學刺激在成骨細胞內作用的“終點”。Li等[11]對成骨樣細胞施加離心力10 min后檢測到Runx2/Cbfa1 mRNA表達水平有短暫地增加改變，認為成骨細胞通過多種復雜途徑響應機械力學刺激。

采用Abe等[12]的方法阻斷BMP信號轉導，使用100 ng·mL-1Noggin預處理24 h，其Runx2 mRNA表達水平可反映Noggin阻斷BMP信號轉導通路的效果，結果顯示，C組與A組和D組間差異無統計學意義，認為D組達到了阻斷BMP信號轉導通路的要求。D組Runx2 mRNA表達水平略高于A組，可能是除BMP信號轉導通路外，其他信號通路對機械離心力刺激響應的效果。

D組Runx2 mRNA表達水平較B組顯著降低。僅阻斷BMP信號轉導通路，從現有理論來講，其他多種力學信號傳遞途徑應不受影響，但是BMP信號轉導通路阻斷后，力學靶點Runx2基因在相同的力學刺激強度下未能完成與B組同等的響應程度，二者對機械離心力刺激響應程度的差異具有統計學意義（P<0.05）。提示BMP信號轉導通路參與了成骨細胞對機械離心力刺激的生理響應過程，而且可能在成骨細胞對力學信號引起的信息傳遞級聯反應中扮演了重要角色。力學刺激可能通過BMP/Smad途徑[13-15]或BMP/p38MAPK途徑[16-17]等入核作用于Runx2等影響成骨特異性基因表達，從而刺激骨形成以響應力學刺激，但其具體機制尚不清楚。BMP信號轉導通路在成骨細胞對機械力刺激響應中發揮了重要作用。BMP信號轉導通路可能介導力學信息傳遞網絡的其他途徑，并在力學刺激引起的信息傳遞級聯反應中扮演重要角色，但還需要進一步研究驗證。

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