重組草酸脫羧酶的表達及酶學性質研究*

林日輝，許麗莉，農勉，張陸成

(廣西民族大學化學與生態工程學院，化學與生物轉化過程新技術廣西高校重點實驗室，廣西南寧，530006)

重組草酸脫羧酶的表達及酶學性質研究*

林日輝，許麗莉，農勉，張陸成

(廣西民族大學化學與生態工程學院，化學與生物轉化過程新技術廣西高校重點實驗室，廣西南寧，530006)

研 究了重組草酸脫羧酶的表達及其酶學性質。經IPTG誘導，每克濕重菌體收獲草酸脫羧酶活力820 U，經Ni－NTA親和層析酶液純化2.07倍，酶活力回收60.38%。酶促反應的最適溫度為50～55℃，最適pH值為3.5，添加EDTA及Fe2+對酶活力有促進作用，Mn2+抑制酶活。在pH4.0，溫度37℃下Km值為14.53 mmol/l，Vmax 為 1 33.33 U/mg。

草 酸脫羧酶，誘導表達，純化，酶學性質

1 材料與方法

1.7 蛋白濃度和酶活力測定

蛋白濃度采用考馬斯亮藍法測定。

草酸脫羧酶活力測定采用終止反應法［12］。反應液含 0.115 mol/L 草 酸 鉀，80 μmol/L MnCl2，50 mmol/L pH值4.0檸檬酸緩沖液，加入草酸脫羧酶液開始反應，10 min后加入等體積的 0.2 mol/L K2HPO4終止反應。過0.20 μm微孔膜除去酶蛋白，采用液相色譜法(HPLC)檢測反應生成的甲酸。色譜柱為 Aminex○Rresin－based 87H 柱，柱溫 65 ℃;流動相為 0.004 mol/L H2SO4，流速 0.6 mL/min;紫外檢測器210 nm檢測;進樣量20 μL。酶活單位定義為:每分鐘催化轉化草酸產生1 μmol甲酸的酶量。

1.8 酶學性質

以純化的草酸脫羧酶為對象，分別研究其最適pH值和pH穩定性、最適溫度和熱穩定性、金屬離子和EDTA對酶活力的影響，以及草酸脫羧酶的動力學常數。

2 結果與分析

2.1 草酸脫羧酶的表達、純化

經IPTG誘導及破碎細胞提取后，每克濕重菌體細菌收獲草酸脫羧酶活力820 U(比活力1.82 U/mg)。層析分離結果如圖1所示。

圖1 酶粗提液親和層析洗脫曲線

由圖1可見，粗提液中蛋白按無吸附、弱吸附、較強吸附3階段洗出。酶活檢測表明，草酸脫羧酶酶活存在于強吸附的分級收集液中。這是由于重組草酸脫羧酶具有6個組氨酸標志，與層析柱Ni2+吸附較強。部分分級洗脫液 SDS－PAGE結果見圖2。SDSPAGE表明重組草酸脫羧酶亞基分子量約44 ku，與文獻報道相符［9］。粗酶液經 Ni－NTA親和層析一步純化，草酸脫羧酶比活提高2.07倍，酶活回收為60.38%。SDS－PAGE 結果也表明，Ni－NTA 親和層析純化酶液中尚有少量雜質，后續實驗需采用其他手段(如凝膠過濾)進一步純化。

圖2 親和層析分級酶液SDS－PAGE圖

2.2 HPLC法檢測甲酸

本研究涉及金屬離子和不同pH對草酸脫羧酶的影響，文獻中大多報道利用甲酸脫氫酶偶聯法檢測草酸脫羧酶催化生成的甲酸，該法的分析結果可能會受到第一個反應的pH或金屬離子影響。為了避免干擾，采用HPLC直接檢測。HPLC對草酸脫羧酶催化反應液的分離及檢測結果見圖3?？梢姴菟崦擊让复呋磻w系簡單，通過HPLC可以有效分離產物甲酸(13.274 min)、反應物草酸(6.876 min)、緩沖劑檸檬酸(7.685 min)。實驗還對比了HPLC法和甲酸脫氫酶法對甲酸定量檢測的準確度，HPLC法的相對標準偏差RSD值、線性回歸方程確定系數R2值都優于酶偶聯法，只是檢測耗時較長。

圖3 HPLC對草酸脫羧酶催化反應液的分離

2.3 草酸脫羧酶的基本特性

2.3.1 最適pH值和pH穩定性

由圖4(A)可知，草酸脫羧酶適宜反應pH偏酸性，最適pH值為3.5。當pH值＞4.5時酶促反應速度隨pH下降，pH值6.5時酶活基本喪失。圖4(B)表明，酸性條件不利于保持草酸脫羧酶的活性。在弱酸性(pH值4.5～6.5)37℃水浴靜置6h后，草酸脫羧酶殘余活性達93.5% ～98.7%;但在pH值3.5條件下，酶活僅剩4.1%。實驗曾以50 mmol/L的pH值8.0磷酸鹽緩沖液在4℃保存草酸脫羧酶30 d，酶活力無顯著損失(剩余活性大于97%)。

圖4 pH值對草酸脫羧酶活力影響

2.3.2 草酸脫羧酶的最適溫度和熱穩定性

如圖5(A)所示，在pH值4.0時，草酸脫羧酶具有較寬的催化溫度范圍，但熱穩定性較差［圖5(B)］。在45～55℃，酶的活性達到最高，相對酶活力超過90%。在37℃溫浴保存60 min，酶活僅損失了3.3%;而在50℃，酶活損失隨時間延長呈線性上升;60℃下處理10 min，酶活僅剩12.7%，60 min酶活已基本喪失?？梢娸^高溫度(50～55℃)雖然加速了酶促反應，但也加速了酶結構的破壞。在應用中采用35～40℃，可獲得較高的相對酶活(大于64%)，又可避免酶失活。

圖5 溫度對草酸脫羧酶活力的影響

2.3.3 金屬離子和EDTA對酶活力的影響

在1 mmol/L的濃度下，金屬離子和EDTA對草酸脫羧酶活的影響見圖6(A)。其中EDTA及Fe2+使酶活力分別提高了9.26%和26.59%;令人感興趣的是:Mn2+使酶活力降低了54.21%;其他測試離子對草酸脫羧酶活力影響不顯著。實驗進一步考察了0.1～10 mmol/L濃度Mn2+對草酸脫羧酶的影響(圖6B)，結果表明，測試濃度范圍內的外加Mn2+對草酸脫羧酶活力的都具抑制作用，低Mn2+濃度下(0.1～0.5 mmol/L)，相對酶活力隨Mn2+濃度提高而下降。

圖6 金屬離子和EDTA對草酸脫羧酶活力影響

2.3.4 動力學常數 Km 及 Vmax的測定

以 1.13、2.26、4.52、5.66、11.31、22.62、45.25、67.87 mmol/L濃度草酸鉀為底物，測定對應的酶促反應速度，用Hanes－Woolf作圖法(圖7)求出草酸脫羧酶的 Km 值為14.53 mmol/L，Vmax為133.33 U/mg。

圖7 草酸濃度與酶促反應速度的關系

3 討論

Mn2+是草酸脫羧酶的組成成分，每個酶亞基分別在N端和C端結構域中各結合1個Mn2+。對草酸脫羧酶催化機理研究表明，活性中心Mn2+的作用直接導致草酸分子 C－C 鍵的異裂［10，12］。然而，反應體系中添加Mn2+對草酸脫羧酶產生抑制作用，目前未見文獻報道。結合添加Mn2+對酶產生抑制，而添加1 mmol/L的EDTA提高酶活力的實驗結果，推測草酸脫羧酶分子上除了N端和C端活性結構域可以緊密結合Mn2+外，還有其他部位可以與Mn2+以較弱鍵的方式結合，這種結合可能改變酶的構象而產生抑制作用;由于在誘導表達過程中使用了濃度為5 mmol/L的Mn2+，其中部分Mn2+以較弱鍵結合于酶活性結構域以外的部位，當反應液中存在離子螯合劑EDTA時，這部分Mn2+得以從酶分子上清除，從而提高了相對酶活。

實驗利用原核表達系統對草酸脫羧酶進行誘導表達，每升發酵液收獲草酸脫羧酶活力1 640 U(約12.33 mg酶蛋白)，遠高于野生菌的誘導表達量［13］。草酸脫羧反應是消耗質子的過程，一定酸度的反應體系利于脫羧的進行，重組草酸脫羧酶適宜反應pH偏酸性(pH值3.5～4.5)，與絲狀真菌來源的草酸脫羧酶相似［14］;但在pH值3.5下酶活力損失嚴重，應用中選擇pH值4.5的反應條件較有利。草酸脫羧酶最適溫度在50～55℃，但該溫度不利于酶的穩定，在實際應用中采用35～40℃，可獲得較高的相對酶活(大于64%)，也避免了高溫對酶結構的破壞。草酸脫羧酶在pH值8.0，4℃下可以較長時間保存，其最大酶促反應速度達133.33 U/mg。上述結果可為草酸脫羧酶的應用提供依據。

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Expression and Characterization of Oxalate Decarboxylase

Lin Ri－hui，Xu Li－li，Nong Mian，Zhang Lu－cheng
(Key Laboratory of New Techniques for Chemical and Biological Conversion Process，College of Chemistry and Ecological Engineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530006，China)

Oxalate decarboxylase was expressed and characterized in this paper.After induced by IPTG，820 U/g(wet weight)of oxalate decarboxylase was obtained，and the enzyme was purified 2.07 fold by metal chelate affinity chromatography with a yield of 60.38%.The enzyme had an optimum temperature between 50 and 55 ℃，and optimum pH at 3.5.Addition of EDTA or Fe2+would activate oxalate decarboxylase，but addition of Mn2+would inhibit the enzyme.Under condition of pH4.0，37 ℃，the enzyme’s Kmwas 14.53 mmol/l with Vmax=133.33 U/mg.

oxalate decarboxylase，expression，purification，characterization

草酸脫羧酶(EC 4.1.1.2)催化轉化草酸為甲酸和CO2，是植物、微生物中草酸代謝降解的主要催化酶之一［1］。草酸脫羧酶目前已用于醫療檢測草酸含量，在食品、工業、農業領域也具有廣闊的應用前景。將草酸脫羧酶制成口服制劑可用于減輕控制尿石癥［2］;構建含草酸脫羧酶基因的乳酸菌可作為益生菌用于防止高草酸尿癥［3］;草酸脫羧酶用于造紙制漿過程可降低流程設備結垢的風險［4－5］;構建含草酸脫羧酶的轉基因作物不但可以降低作物草酸含量，改善作物品質，還可提高作物對病原真菌的抗病力［6－7］。

目前，已有關于草酸脫羧酶酶學性質的研究［8－9］。然而，由于菌株來源及檢測方法差異，報道的結果差異較大;此外，金屬離子對酶的影響都是以誘導表達狀態下添加不同離子進行分析［10－11］，金屬離子對酶促反應的直接影響未見報道。本研究在原核表達系統對B.subtilis來源的草酸脫羧酶進行誘導表達，利用親和層析一步純化，獲得純度較高的重組酶;采用HPLC分析酶活的方法，研究了重組草酸脫羧酶的酶學性質。本研究為深入研究草酸脫羧酶的催化機理，擴大其應用領域提供依據。

1.1 菌種

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK由本實驗室保存。

1.2 培養基

LB培養基組成:1 L培養基含蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，pH7.0。固體培養基添加 18 g瓊脂粉。

1.3 試劑

草酸鉀、甲酸鈉、甲酸脫氫酶，購自Sigma公司;HisTrap HP親和柱、PD－10脫鹽柱為Amersham產品;IPTG、NAD+、胺芐青霉素購自上海生工;其他試劑均為國產分析純。

1.4 主要儀器及設備

液相色譜儀(日本島津);凝膠成像系統(美國伯樂);快速蛋白液相色譜系統(美國通用);紫外分光光度計(上海普析)。

1.5 草酸脫羧酶的表達

將基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK培養至 OD600為0.4時，42℃熱沖擊 5 min，加人5 mmol/L MnCl2，0.4 mmol/L IPTG，誘導表達 4 h 后，離心收集菌體，以pH8.0磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲破碎收集上清為粗酶液。

1.6 草酸脫羧酶的純化

使用AKTA－FPLC系統進行酶純化。先以5倍柱床體積 A緩沖液(含20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L的pH8.0磷酸鹽緩沖液)平衡柱床。粗酶液過0.2 μm孔徑膜后上柱，按以下程序洗脫:含0%的 B緩沖液(含20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L的 pH8.0磷酸鹽緩沖液)沖洗 75 mL，含10%的 B緩沖液沖洗40 mL，B液10%至100%線性梯度洗脫50 mL。洗脫流速為l mL/min。分級酶液利用SDS－PAGE進行分析鑒定。

收集分級酶液經超濾濃縮后，使用PD－10柱脫鹽。根據使用說明，先以50 mmol/L的pH8.0磷酸鹽緩沖液平衡20 mL，上樣2.5 mL，待樣品全部進入柱床，加入緩沖液洗脫，收集前3 mL洗脫液即為脫鹽的草酸脫羧酶。

博士，副教授(Email:linrihui_0@yahoo.com.cn)。

*廣西民族大學重點項目科研基金(200701YJ01)，化工過程創新技術研發平臺建設(桂科能0992028－13)資助課題。

2010－10－06，改回日期:2010－12－01