新型黑素細胞涂布法移植卡波姆膠載體制備研究

魯嚴，周梅華，李雪，吳迪，王大光，朱文元

（南京醫科大學第一附屬醫院,南京 210029）

自體黑素細胞移植是一種常用的治療穩定期白癜風的外科療法，該療法原理是將自身正常表皮的黑素細胞通過體外培養擴增后移植到白癜風皮損處，使此處黑素細胞得以補充、成活，從而在皮損處產生色素。以往該法因細胞懸液滴種時常因受植部位、體位的變化，常常不能均勻分布，復色效果會受到影響，我們擬研制一種以卡波姆（carbomer）膠為基質的載體，克服以上缺點，可以用于黑素細胞涂布法移植，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 卡波姆940購自美國Noveon公司，Ham F12培養基、DMEM培養基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、胰蛋白酶、分散酶（dispase enzyme）購于美國 Gibco 公司，geneticin（G418）、左旋多巴（Laevodopa,L-DOPA）、12-0-十四酰佛波醇-13-乙酸酯（12-0-Tetradecanoylphorbol 13-acetate,TPA）、 噻 唑 藍 [3-（4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide,MTT]均購于美國Sigma公司。實驗家兔由南京醫科大學動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 黑素細胞培養 標本來自我院泌尿外科健康男性包皮環切術后丟棄表皮組織。按照Swope等的方法[1]，去除包皮的皮下組織，并剪成小皮片，經Dispase酶4℃消化分離表真皮，表皮經0.25%胰蛋白酶消化后獲得單細胞懸液，接種于含常規黑素細胞培養基的培養瓶中，置于5%CO2培養箱37℃孵育。6 h后換液1次去除未貼壁細胞，48 h后改用不含geneticin的培養基，3天后換液，加入含40 μg/L TPA的黑素細胞培養基進行純化培養。當細胞長滿70%～80%時，用2.5 g/L胰酶消化傳代。黑素細胞鑒定采用 HMB45（human melanoma black-45）和馬森卡塔納氏（Masson-Fontana）染色。

1.2.2 卡波姆膠半固體培養基的配置 稱取卡波姆9 405 g，與500 mL含TPA的培養基混合均勻，即得質量分數為1%卡波姆940黑素細胞載體膠液，注意配制時將卡波姆940干細粉分次撒于培養基液面上，使其充分溶脹，避免結塊。測定PH，10 mol/L NaOH調PH至6.5呈凝膠狀。

1.2.3 卡波姆膠對黑素細胞毒性和增殖的影響 （1）對黑素細胞成活率的影響：取對數生長期的黑素細胞，以濃度5×105/mL 1mL接種于6孔板內，加入1%卡波姆940黑素細胞載體膠液進行培養，同時設空白對照。5%CO237℃分別培養 1 h，3 h，6 h，12 h，24 h及36 h后2 500轉/min離心15 min收集細胞，TPA黑素細胞培養液洗滌2次，常規臺盼藍染色測定細胞成活率。（2）對黑素細胞增殖的影響：取對數生長期的黑素細胞，以濃度5×105/mL 200 μL接種于96孔板內，加入1%卡波姆940黑素細胞載體膠液進行培養，同時分別設常規黑素細胞培養基對照。分別培養 1 h，3 h，6 h，12 h，24 h 及 36 h 后2 500轉/min離心15 min，吸棄卡波姆膠后換為常規黑素細胞培養基，每孔再加入MTT液（5 g/L）20 μL，充分混勻繼續培養4小時后棄上清液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）150 μL，振蕩10 min左右；置酶標儀于490 nm波長測吸光度值（A），細胞增殖率用藥物處理組A值/空白對照組A值的百分數表示。

1.2.4 卡波姆膠對黑素細胞遷移的影響 Transwell培養板的小室由帶8.0 μm孔徑微孔的聚碳酸酯膜分成上下2室，該膜必須于試驗前1天用含有5 μg纖維連接蛋白的黑素細胞培養液500 μL包被，室溫過夜晾干。將1%卡波姆940黑素細胞載體膠液與黑素細胞（5×105/mL）混合凝膠加于上室（聚碳酸酯膜上），并設空白對照，分別培養6 h，12 h，24 h取出聚碳酸酯膜并用甲醇固定，HE染色，膜上層（未遷移到下層）的黑素細胞及凝膠用棉拭子輕輕擦去，高倍鏡下隨機取4個高倍視野計數通過8.0 μm孔徑微孔膜遷移到膜下層的黑素細胞。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件對實驗結果進行t檢驗，P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 卡波姆膠對黑素細胞毒性和增殖的影響 在1%卡波姆膠作用黑素細胞 1，3，6，12，24 及 36 h后，黑素細胞的成活率和增殖率分別與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見圖1、表1。

表1 卡波姆膠對黑素細胞成活率和增殖率的影響 (n=4,±s）

表1 卡波姆膠對黑素細胞成活率和增殖率的影響 (n=4,±s）

注：與對照組比較，a：P<0.05，b：P＜0.01。

組別對照組1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 36 h細胞成活率（%）100 98.79±1.10 97.84±1.66 97.65±1.91 97.03±3.17 96.75±2.62 94.39±4.61細胞增殖率（%）100 96.35±2.40 95.68±2.91 94.24±3.71 93.90±3.94 93.66±4.33 92.79±4.84

2.2卡波姆膠對黑素細胞遷移的影響 1%卡波姆膠作用6 h時分別與對照組和其他時間組比較，黑素細胞的遷移受到抑制，差異具有統計學意義（P<0.05）；1%卡波姆膠作用12 h、24 h分別與對照組比較，黑素細胞的遷移率無明顯差別（P>0.05）；1%卡波姆膠作用24 h黑素細胞的遷移率略強于12 h（P<0.05），結果見圖2、表2。

表2 1%卡波姆膠作用不同時間對黑素細胞遷移的影響 (n＝5,±s)

表2 1%卡波姆膠作用不同時間對黑素細胞遷移的影響 (n＝5,±s)

時間6 h 1 2 h 2 4 h對照組3 1.3±2.5 5 0.0±7.5 8 6.0±8.9 1%卡波姆膠組1 2.7±4.5 a 4 3.0±4.0 7 4.3±5.7

3 討論

卡波姆 (carbomer)又名聚羧乙烯(carboxy polymethleme,CP)，是一種由丙烯酸與烯丙基蔗糖交聯而成的高分子聚合物，其化學名為Carboxypolymethylene，卡波姆膠是一種多用途的高分子材料和藥用輔料，在國內外被廣泛應用于藥品和化妝品的研制生產，最早由美國Goodrich公司生產，現已收入美、英等國藥典,我國2000年版藥典就已收載[2]?？ú纺z作為黑素細胞涂布法移植的載體國內外未有報告。

我們的預實驗表明：采用黑素細胞培養基配置的1%卡波姆膠對黑素細胞共培養1 h，3 h，6 h，12 h，24 h及36 h后，分別用臺盼蘭測定黑素細胞存活率及MTT測定細胞增殖能力，結果顯示不同時間點測定組與對照組比較差異無統計學意義，另Transwell培養板測定發現1%卡波姆膠在12 h后對黑素細胞遷移無影響。以上結果顯示采用卡波姆膠混合黑素細胞，不影響體外培養的黑素細胞生物學功能，可以作為新型涂布法移植的細胞載體。

早在1998年有人將組織工程學應用于白癜風細胞移植。Olsson[3]等將制備好的表皮基底細胞懸液均勻的移植到色素脫失部位，外用膠原薄膜封包，膠原膜對黑素細胞的定植生長有益處。以后又有人使用組織工程材料比如羧酸、殼聚糖凝結成膜包被的培養基，可以明顯改善細胞的生成條件，并減小收獲細胞時對細胞造成的損傷[4-5]。Van GeelN[6]將透明質酸摻入到自體黑素細胞懸液中，增加細胞的黏

度，并還可以促進黑素細胞的生長和增殖。近年來，有報告使用羊膜作為移植載體，可用于黑素細胞移植。將培養擴增后的細胞轉移到該膜上，培養后應用到色素脫失部位,取得95%以上的復色率[7]。本研究不同于以往組織工程的概念，將卡波姆膠引入作為黑素細胞的載體系統，可以起到很好的固定作用，從而解決現有的黑素細胞移植過程中細胞懸液易流失的問題，減少黑素細胞的流失量，提高植入率并且不會對黑素細胞造成損傷，在臨床應用中，操作簡單安全。另外，由于該化合物本身是優良、安全的高分子材料和藥用輔料，型號多樣，可適應多種劑型的特點，如作為凝膠基質、生物黏附材料、緩控釋骨架材料等，在藥學領域已經廣泛應用[8]，加之具有廉價、容易獲得的特點，經以上前期實驗研究結果證實，對于用于黑素細胞涂布法移植的臨床實施具有十分廣闊的應用前景。

［1］Swope VB,Medrano EE,Smalara D,et al.Long-term pro1iferation of human melanocytes is supported by the physiologic mitogens alpha-melanotropin endothelin-l，and basic fibroblast growth factor.Exp Cell Res,1995,217:453-459.

［2］中華人民共和國藥典（2000年版2部）[M].北京：化學工業出版社，2000：133.

［3］Olsson MJ,Juhlin L.Leucoderma treated by transplantation of a basal cell layer enriched suspension[J].Br J Dermatol,1998,138:644-648.

［4］Eves PC,Bullett NA,Haddow D,et al.Simplifying the delivery of melanocytes and keratinocytes for the treatment of vitiligo using a chemically definedcarrier dressing[J].J Invest Dermatol,2008,128:1 554-1 564.

［5］Lin SJ,Jee SH,Hsaio WC,et al.Formation of melanocyte spheroids onthechitosan-coatedsurface[J].Biomaterials,2005,26:1413-1422.

［6］van Geel N,Ongenae K,DeMilM,et al.Modified technique of autologous noncultured epidermal cell transplantation for repigmenting vitiligo:a pilot study[J].Dermatol Surg,2001,27:873-876.

［7］Redondo P,del Olmo J,García-Guzman M,et al.Repigmentation of vitiligo by transplantation of autologous melanocyte cells cultured on amniotic membrane[J].Br J Dermatol,2008,158:1 168-1 171.

［8］盧毅，張彤，陶建生.卡波姆在藥劑學中的應用[J].中國醫藥工業雜志[J]，2007，38（6）：457-460.