白細胞介素1α對人永生化角質形成細胞、水通道蛋白3表達的調節

閆學文，單士軍

（1.天津市中醫藥研究院附屬醫院，天津300120；2.天津醫科大學總醫院，天津 300154）

中波紫外線（ultraviolet B,UVB）照射后，角質形成細胞（keratinocyte cell,KC）產生多種細胞因子，其中白細胞介素 1α（interleukin-1α,IL-1α）與皮膚光老化的作用極為密切。作為一種前炎癥介質，IL-1α在UVB急性損傷后直接或間接影響皮膚中的免疫細胞及周圍細胞，在免疫調節、炎癥發生以及促進組織增生方面起了重要作用[1]。研究表明，水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）表達于正常皮膚的基底細胞細胞膜，是水和甘油的轉運通道。在皮膚炎癥、應激或某些慢性疾病以及腫瘤等情況下，AQP3表達發生變化[2]。但IL-1α和AQP3之間的關系尚未見報道。本研究以體外培養的人永生化角質形成細胞（HaCaT）為靶細胞，觀察IL-1α處理后HaCaT細胞AQP3 mRNA和蛋白表達的變化。初步探討其作用機理和臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 HaCaT由德國柏林自由大學本杰明·富蘭克林醫學中心惠贈。

1.1.2 主要試劑細胞培養液和胎牛血清購自美國Hyclone公司?？谷薃QP3多克隆抗體由萬寅生教授惠贈。Trizol RNA提取試劑為Invitrogen公司產品?？俁NA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、RealMasterMix新型熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。引物由北京賽百盛公司合成。重組人IL-1α購自美國CaliforniaBioscience公司。

1.1.3 引物設計自行設計引物。內參GAPDH，上游引物:5′-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3′；下游引物，5′-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3′；擴增產物313 bp。AQP3，上游引物：5′-GCT GTC ACT CTG GGC ATC CTC-3′；下游引物：5′-GCG TCT GTG CCA GGG TGT AG-3′；擴增產物 133bp。

1.2 主要儀器設備 細胞培養超凈臺（蚌埠凈化設備廠）、CO2培養箱（Queue SystemsTM2711美國）、倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，I×70日本）、全能型高性能臺式冷凍離心機（Heaeus,Biofuge Stratos德國）、深低溫冰箱（SANYO，Altra Low日本）、蒸汽高壓消毒箱（Tuttnauer,2540 MK美國）、550型酶標儀（Bio-Rad Laboratories Inc,Hercules加拿大）、實時定量熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）儀（Rotor-gene 3000,澳大利亞）、Waldmann窄波UVB治療儀（Waldmann，UV801KL德國）。

2 實驗步驟

2.1 細胞培養 HaCaT細胞生長于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養液中，置于5%CO2、37℃孵箱中傳代培養。

2.2 L-1α處理 待HaCaT細胞生長至約80%融合，棄培養基，PBS沖洗，加入不含血清的DMEM培養基，加IL-1α繼續培養。

2.3 實驗分組 1)陰性對照組:培養液對照；2）加入 IL-1α 1、10、100 μg/L，培養 24 h 后檢測信使核糖核酸（massenger ribose nucleic acid,mRNA）及蛋白的變化；加入 IL-1α 10 μg/L，分別培養 6、12、24 h后檢測mRNA及蛋白的變化。收集的培養上清或細胞保存于-80℃深低溫冰箱或直接實驗。每組實驗重復3次。

2.4 實時熒光定量反轉錄酶-聚合酶全連鎖反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR）檢測AQP3 mRNA表達

2.4.1 總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA （1）收集HaCaT細胞，向每管約5×106個細胞中加入0.5 mL Trizol總RNA提取試劑，輕輕吹打，將均漿樣本放于室溫5 min，使核酸蛋白復合物完全分解。（2）加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置10min。（3）4℃，12000轉/min離心15 min。（4）小心將上層無色水相移至新的Eppendorf管中。（5）緩慢加入1倍體積70%乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起轉入試劑盒提供的吸附柱中。（6）4℃下以12 000×g的速度離心10 min，離心后在管的底部及管壁可以看到凝膠狀RNA小滴。棄去收集管中的廢液，加入1 mL 75%乙醇洗RNA小滴1次，渦旋混合樣本。（7）4℃下以7 500×g的速度離心5 min，室溫下空氣干燥5～10 min。（8） 用 0.1 mL焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate,DEPC）水溶解RNA，55～60℃孵育10min。（9）取10μLRNA溶液，加990μLDEPC水稀釋，在紫外分光光度計內測定RNA溶液在260nm及280nm處的光密度（A）值。A 260/A 280>1.7時標本可用，否則重新提取。根據A 260值計算RNA濃度。

2.4.2 逆轉錄 （1）在冰浴的無核酸酶的離心管中加入 2 μg總 RNA，2 μL Random，2 μL dNTP，補RNase-free水定容至 13.5 μL。（2）70℃加熱 5 min后迅速在冰上冷卻2 min，瞬時離心收集反應液后加入 4 μL 5 × first-strand buffer,1 μL 0.1MDTT，0.5 μL RNasin。（3） 加 1 μL TIANScript M-MLV 混勻。25℃溫浴10 min，42℃溫浴50 min，95℃加熱5 min終止反應，RNase-free ddH2O將體系稀釋至30 μL，-20℃凍存備用。

2.4.3 PCR 反應 （1）20×SYBR solution室溫平衡并徹底混勻。（2）將 125 μL 20×SYBR solution 加入至1 mL 2.5×RealMasterMix中。（3）在平頭PCR管中分別加入 2.5×RealMasterMix/20×SYRB solution 9 μL，正向引物及負向引物各2 μL，逆轉錄產物 2 μL，超純水 5 μL。反應體系為 20 μL。（4）在 RG3000 定量PCR儀上按照RealMasterMix新型熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR反應：95℃起始變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。用雙標準曲線法對AQP3基因進行相對定量測定。實驗結果重復3次。

2.5 western blot分析

2.5.1 收集細胞 胰蛋白酶消化各組培養的HaCaT細胞，離心后收集。

2.5.2 總蛋白的提取 在盛有收集好細胞的Eppendorf管中加入500 μL蛋白裂解液（50 mm Tris-HclpH7.4，150mmNacl，0.l%SDS,1%Triton-100；1mmEDTA pH8.0），冰浴下超聲粉碎。4℃12000轉/m，離心30 min。

2.5.3 樣品蛋白濃度的定量樣本取25 μL+2.5 mL堿性銅液室溫靜置20 min，加入0.25 mL酚試劑室溫靜置30 min?？瞻坠軜悠芬?5 μL BD H2O代替。722s分光光度計測光密度值，計算蛋白濃度。

2.5.4 濃度的調整與樣品的處理把樣品調成相同濃度，濃度高的用蒸餾水補充，然后加入buffer，Eppendorf管用沸水煮5 min（使蛋白變性）。

2.5.5 電泳、轉膜、雜交、染色:取20 μL細胞裂解液進行不連續10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳，90V恒定電壓使溴酚藍染料從4%濃縮膠進入8%分離膠后，以120 V恒定電壓電泳至適當位置，4℃條件下用半干式電轉儀將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉非特異性蛋白，室溫，過夜。封閉好的膜用緩沖液TTBS（0.5 mL Tween-20加到1 000 mL TBS中。TBS組成：4.84 Tris，58.48 Nacl，溶于去離子水中，用 Hcl調PH至7.5）沖洗2次，每次5 min，按說明書要求的濃度加入待檢測的一抗，室溫2 h。TTBS沖洗2次，每次5 min。加堿性磷酸酶標記的相應二抗，室溫孵育2 h。TTBS沖洗2次，每次5 min，TBS沖洗1次，5 min，加入堿性磷酶顯色液顯色，10～30 min后看結果。結果采用FluorChem 2.0分析軟件掃描定量。

3 統計學處理

相應數據用SPSS 12.0統計包進行分析，兩樣本均數比較用t檢驗，多樣本均數比較用方差分析，以P＜0.05有統計學意義。

3.1 IL-1α 1、10、100 μg/L 處理后 HaCaT 細胞AQP3 mRNA表達的變化分析實時定量PCR結果，以陰性組為基準，預設其AQP3 mRNA表達水平為1.0，采用單因素4水平設計定量資料的方差分析，顯示四組之間總體來說差別有統計學意義（P<0.0001）。組間比較采用snk檢驗，各組之間差異均有統計學意義，見表1。

3.2 western blot分析結果 western blot結果顯示，IL-1α 1、10、100 μg/L 處理后，HaCaT 細胞 AQP3 蛋白表達下降，以100 μg/L組下降最為明顯。10 μg/L處理6 h下降最為明顯，至12 h表達逐漸回復，見圖 1，2。

表 1 IL-1α 1、10、100 μg/L 對 HaCaT 細胞AQP3 mRNA表達的影響

4 討論

AQP3是的水和甘油透膜轉運的通道蛋白，僅表達于正常皮膚基底細胞細胞膜上[3]。在某些生理或病理情況下，AQP3表達發生變化。有研究表明，當體外培養的HaCaT細胞處于高滲狀態時，AQP3 mRNA表達上調，尤其是當處于山梨醇的高滲環境中[4]，但其機制未明。在特應性皮炎急性期或慢性期，AQP3 mRNA表達上調，并且表達位置亦較正常的基底細胞層上升，棘細胞層也表達AQP3。這和特應性皮炎患者透皮失水，皮膚干燥有密切的聯系[3]。但AQP3在特應性皮炎過表達的機制尚不明確。另有研究報道，當機體處于炎癥狀態下，前炎癥介質TNF-α也可以促進AQP3過表達，同時表達部位發生變化[2]。由此可見，目前對AQP3在體內體外各種生理、病理情況下發生的表達變化機制并不明確。我們的實驗結果表明，IL-1α作用于體外培養的HaCaT細胞，在mRNA和蛋白水平均有明顯的抑制作用，并具有劑量/時間-效應關系，這一變化發生的機制尚需要進一步的探討。

UVB照射后可以增加HaCaT細胞IL-1α的分泌，而IL-1α又可以抑制HaCaT細胞AQP3的表達[5]。同時我們也觀測到UVB照射后HaCaT細胞AQP3表達的抑制。因此我們不能確定是UVB照射后直接通過信號傳導機制誘導了AQP3表達的抑制，還是通過IL-1α間接抑制了AQP3表達的表達，值得我們進一步研究。

［1］Hara-Chikuma M,Verkman AS.Aquaporin-3 facilitates epidermal cell migration and proliferation during wound healing[J].J Mol Med(Berl),2008,86:221-231.

［2］Tancharoen S,Matsuyama T,Abeyama K,et al.The role of water channel aquaporin 3 in the mechanism of TNF-alpha-mediated proinflammatory events:Implication in periodontal inflammation[J].J Cell Physiol,2008,217:338-349.

［3］Sugiyama Y,Ota Y,Hara M,et al.Osmotic stress up-regulates aquaporin-3 gene expression in cultured human keratinocytes[J].Biochim Biophys Acta,2001,1 522:82-88.

［4］Olsson M,Broberg A,Jernas M,et al.Increased expression of aquaporin 3 in atopic eczema[J].Allergy,2006,61:1 132-1 137.

［5］Ho JN,Lee YH,Lee YD,et al.Inhibitory effect of Aucubin isolated from Eucommia ulmoides against UVB-induced matrix metallopro teinase-1 production in human skin fibroblasts[J].Biosci Biotechnol Biochem,2005,69:2 227-2 231.