白細胞介素4對體外培養人黑素細胞增殖及黑素合成的影響

陳靜宇 ，林新瑜 ，王芳 ，林鴻剛

（1.成都市第六人民醫院，成都610051；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院，成都610072；3.四川大學國家生物治療重點實驗室，成都 610041）

黃褐斑、白癜風等是臨床上常見的色素障礙性疾病，目前其發病機制還不十分清楚,治療難度也較大。皮膚顏色的深淺主要取決于黑素細胞產生黑素的量和分布。通過黑素細胞的體外純培養可以研究色素障礙性疾病的發病機制，篩選治療這些疾病的藥物和方法。本研究建立正常人表皮黑素細胞體外培養體系，采用不同濃度的白細胞介素 4（interleukin-4，IL-4）作用于體外培養的黑素細胞，觀察其對黑素細胞增殖及黑素合成的影響，為臨床應用IL-4治療色素性疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 MCDB-153培養基，牛胰島素，人轉鐵蛋白，左旋多巴（levodopa,L-Dopa），IL-4，二甲基亞砜（DimethylSulphoxide），MTT均購自美國Sigma公司。重組人表皮生長因子（recombinant human epidermal growth factor,rhEGF）購于美國Peprotech公司。牛垂體提取物（bovine pituitary extract,BPE）購于美國Invitrogen公司。10%新生小牛血清購自Hyclone公司。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）購自美國Gibco公司。氫化可的松0.5 μg/mL，青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL，胰蛋白酶，臺盼蘭均系國產。培養瓶、96孔板和6孔板均購于美國Corning公司。顯微鏡：觀察細胞用的是OLYMPUS CK2型號；細胞計數用的是OLYMPUS CKX41型號，照相用的OLYMPUSCH2型號；酶聯免疫檢測儀；流式細胞儀。標本經患者知情同意后取自18～35歲行包皮環切術的正常人包皮。

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素細胞的培養[1-4]將上述包皮放入含青霉素、鏈霉素濃度為100 IU/mL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，取出后在超凈臺上用組織剪剪去皮下組織，再用PBS液反復徹底沖洗。移入含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶約20 mL的無菌瓶中，蓋緊，于4℃冰箱中消化18～24 h。棄去胰蛋白酶，加入PBS液洗滌組織塊數次。用眼科鑷剝離角質層，可見角質層下面附著一層呈黑色的細胞，去除角質層后將組織塊移入新的PBS液中振蕩輕刮將黑素細胞層懸浮，再將含有黑素細胞的液體收集至離心管中。用PBS液反復離心洗滌細胞懸液3次，每次1 500轉/min離心3 min。棄上清，將細胞沉淀物用黑素細胞生長培養基重新懸浮，并用臺盼蘭染色計數（細胞活力≥95%），按2×105個/cm2的細胞密度接種于6孔板中，于37℃、5%CO2條件培養48 h后換液去除未貼壁細胞，以后適時更新培養液。

1.2.2 黑素細胞鑒定[5]

1.2.2.1 左旋多巴（L-Dopa）染色 將傳代純化后的黑素細胞，經含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化后接種于已預先放置蓋玻片的6孔板內，待細胞貼壁并穩定生長后棄去培養液，并用預熱的PBS液洗滌數次。用2.5 g/L戊二醛固定后，加入用黑素細胞培養液配制的1 g/L L-Dopa，37℃孵育4 h，其間換液1次，風干后甘油封片，照相。

1.2.2.2 Fontana銀染 在0.15%硝酸銀溶液中加入適量氨水配制成氨銀液，將傳代純化的黑素細胞用戊二醛固定后加入氨銀液，避光浸染約30 min，PBS液漂洗3次后置倒置顯微鏡下觀察，照相。

1.2.2.3 S-100蛋白免疫組化染色 將傳代純化后的黑素細胞，經消化后接種于已預先放置蓋玻片的6孔培養板內，待細胞貼壁后去掉培養液。用2.5 g/L戊二醛固定后，PBS液洗滌數次，加入3%的H2O2，室溫30 min，以去除內源性過氧化物酶；再次用PBS液洗滌數次，滴加1∶20稀釋的羊血清，室溫下處理15 min；加入1∶200兔抗S-100蛋白的多克隆抗體，4℃過夜；洗滌后加入生物素標記的羊抗兔抗體，37℃、濕盒孵育1 h，再次洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，37℃、濕盒孵育1 h。洗滌后二氨基聯苯胺（DAB）染色，蒸餾水適時終止，蘇木素復染后用加拿大膠封片，照相。

1.2.3 黑素細胞增殖的測定 采用四甲基偶氮唑藍比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）。倒置顯微鏡下觀察，細胞培養至80%匯合時，棄培養液上清，加入含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶共1～1.5 mL，在75 cm2的細胞培養瓶內37℃孵育3～5 min，鏡下觀察約80%脫落，加入5 mL左右的含有10%新生小牛血清的MDCB-153培養基終止消化，轉移細胞懸液到15 mL離心管，1 500轉/min離心3 min，棄去上清，加入適量含有10%血清的MDCB-153培養基重懸細胞團塊，吸取100 μL到一個無菌的500 μL的EP管中，加入等量的0.8%的苔盼蘭溶液，室溫下混勻5 min，吸取100μL混合液于血細胞計數板計數。按20000個/mL接種到96孔板中，每孔 150 μL，37 ℃，5%CO2孵箱過夜培養。

第2天，棄去培養基上清，加入新鮮的MDCB-153培養基100 μL/孔，備用。以無菌PBS配置的IL-4 溶液，其終濃度分別為 50，100，200 μg/L，備用。無菌加入100 μL相應濃度的IL-4溶液，同時設立PBS和空白對照組，各個濃度各設5個復孔。處理后分別培養24，48，72 h。相應處理時間后，分別棄去培養基上清，加入含MTT終濃度為0.5 g/L的新鮮MDCB-153培養基繼續培養4 h，800轉/min離心3 min，棄去培養基上清，加入150 μL的DMSO溶解甲瓚，37℃孵育15 min，于波長為495 nm處測吸光度值，記錄數據，按公式計算其凈抑制率。抑制率=（對照組-實驗組）/對照組×100%，凈抑制率=各組的抑制率-溶劑對照組（PBS）的抑制率。

1.2.4 黑素合成的測定 采用氫氧化鈉（NaOH）法。將處理后的黑素細胞棄去上清液。PBS洗3次，用含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化3 min后，分別計數后調整細胞數目，取等數量的細胞離心后重懸于100 μL的0.5 mmol/L的NaOH溶液中，37℃孵育1 h后，各管加入400 μL的蒸餾水稀釋后，分別于405 nm處和450 nm測量吸光度值，按公式計算其抑制率。黑素合成抑制率=[1-（藥物孔吸光度值÷藥物孔細胞密度）÷（對照孔吸光度值÷對照孔細胞密度）]×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測 細胞培養，計數等如前，按2×105/孔接種到6孔板，濃度100 μg/L的IL-4處理組和PBS對照組，空白對照組設置如前，細胞處理72 h后，分別收集培養基上清到離心管中，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，消化終止如前。分別收集細胞懸液轉到相應的已經收集有各自上清的離心管里，1 500轉/min離心3 min，棄去上清，加入無菌的PBS重懸細胞團塊，1500轉/min離心3min，重復3次PBS清洗過程后，棄去上清，加入PI溶液，室溫避光孵育30 min，上機檢測。

1.3 統計學處理 全部數據采用SPSS10.0版統計軟件進行分析。

2 結果

2.1 形態學結果 體外培養的正常人黑素細胞為雙極、三極和多極的樹突狀細胞，細胞增殖良好,細胞樹突之間交織成網，見圖1。

2.2 黑素細胞鑒定

2.2.1 L-Dopa染色 第3代黑素細胞經0.1%LDopa染色后鏡下見黑素細胞胞質及樹突均被染成灰黑色，見圖2。

2.2.2 Fontana銀染 第3代黑素細胞經氨銀液避光浸染30 min，細胞被染成黑色，見圖3。

2.2.3 S-100蛋白染色 黑素細胞胞質及樹突呈棕黃色陽性著色從而可以鑒定為黑素細胞，見圖4。

2.3 不同濃度IL-4對人正常皮膚黑素細胞增殖率（%）的影響 黑素細胞增殖的測定結果見表1，2。

表1 不同濃度IL-4與PBS作用于黑素細胞后的抑制率的比較

表2 不同濃度IL-4作用于黑素細胞后的凈抑制率比較

抑制率=（對照組-實驗組）/對照組×100%。凈抑制率=各組的抑制率-溶劑對照組（PBS）的抑制率。隨作用時間增加，黑素細胞凈抑制率逐漸增加，而且隨IL-4的濃度增加，黑素細胞的凈抑制率也逐漸增加，說明其對黑素細胞的作用呈現出時間和劑量的相關性。

2.4 黑素合成的測定結果 405 nm處和450 nm處分別測量吸光度值，按公式計算其黑素合成抑制率，均可見IL-4作用后黑素合成抑制率增加，而且IL-4組與PBS組比較差異均有統計學意義（P<0.05#），見表3。

表3 IL-4作用于黑素細胞后的黑素合成抑制率的比較

2.5 流式細胞術檢測 濃度為100 μg/L的IL-4作用于黑素細胞72 h后用流式細胞術檢測的結果：空白對照組黑素細胞凋亡率為4.0%，溶劑PBS組黑素細胞凋亡率為 6.7%，IL-4（100 μg/L）組黑素細胞凋亡率為59.2%。IL-4（100 μg/L）組黑素細胞凋亡率與空白對照組及溶劑PBS組比較差異有統計學意義（P<0.01）。

3 討論

黑素的合成是個極其復雜的過程，在體內受細胞因子、金屬離子、激素水平等各種因素的調節。黑素合成與機體免疫應答及細胞因子間相互作用已引起學者們的關注。Th細胞按其分泌細胞因子不同而分為Th1和Th2亞群，前者分泌IL-2，γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）；后者分泌 IL-4、IL-5、IL-10等[6]。Th1和Th2之間相互調節、相互制約，處于動態平衡，維持機體正常的細胞免疫和體液免疫。Th1細胞分泌的細胞因子參與T細胞介導的細胞免疫，而Th2細胞分泌的細胞因子參與體液免疫。IL-4是一種Th2型細胞因子，具有調節Th1/Th2型細胞因子平衡作用[7]。隋連金等[8]采用酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）法測定白癜風患者血清IL-4水平，并與正常對照組相比較，結果發現白癜風患者血清IL-4水平增高,且進展期高于穩定期，提示此種細胞因子可能參與白癜風發病，并與白癜風的活動有關。其作用可能與細胞因子及一些化學介質如：一氧化氮（NO）、神經肽（NPY）等的相互作用有關[9]。鐘文俊等[10]發現白癜風患者在進行戶外紫外線（ultraviolet radiation B，UVB）照射前局部組織液的IL-4、IFN-γ水平均較高，表明在白癜風的皮損處，Th細胞有較高的表達，而在治療后IL-4、IFN-γ水平均下降，提示可能在UVB照射下Th細胞活性受抑制。黑素細胞的培養在皮膚色素性疾病、惡性黑色素瘤等的研究和治療中具有重要意義。IL-4對體外培養的黑素細胞的作用國內尚無相關報道。本研究建立正常人表皮黑素細胞體外培養體系后，用不同濃度的IL-4作用于黑素細胞后也發現IL-4對黑素細胞活力有抑制作用，能使細胞增殖力降低，黑素合成減少，增加黑素細胞的凋亡率。這為臨床應用IL-4治療色素性疾病提供了實驗依據，但是IL-4是通過什么機制達到這些作用還有待進一步的研究。

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