瓊脂擴散法檢測卵黃抗體效價影響因素的分析

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瓊脂擴散法檢測卵黃抗體效價影響因素的分析

王尚明①吳好停②宗玉東③（①山東迅達康獸藥有限公司 濟南 250316 ②中國獸醫藥品監察所 北京 ③山東省廣饒縣畜牧局）

抗體瓊脂擴散試驗是當前卵黃抗體效價測定的主要方法之一，該方法簡潔、快速非常適合于臨床中應用，但是該方法容易受到多種因素的影響而導致試驗結果判斷的不準確。本文就瓊脂擴散試驗中抗原抗體本身性質、反應特點、最適比例、可逆性、總量以及瓊脂、水等所有能影響試驗結果的因素進行了逐一分析。

卵黃瓊脂擴散試驗是通過抗原、卵黃抗體在瓊脂凝膠中由近及遠不斷自由擴散形成濃度梯度，在適當比例處相遇形成沉淀線，并由此來判斷抗體效價的一種技術。瓊脂擴散試驗主要是用于可溶性膠原性抗原及其所對應抗體水平的檢測，獸醫臨床中主要用于法氏囊病、新城疫等抗體效價的檢測。由于卵黃內抗體效價與雞體血清內的效價幾乎相同，所以通過瓊脂擴散試驗測定卵黃抗體的效價，可以在不刺激雞體的情況下就可知道產蛋雞的抗體水平和免疫效果。卵黃瓊脂擴散試驗操作簡單、所用的儀器少、結果易判斷，因此被越來越多的養殖戶、獸醫工作者所采用，成為制定產蛋雞免疫程序的主要依據。但是瓊脂擴散試驗的結果容易受到抗原抗體因素、瓊脂、反應條件以及其它因素的影響而導致抗體效價測定不準確。為了能使臨床中廣大實驗操作人員在瓊脂擴散試驗中獲得一個更加準確的結果及正確認識，現將以上各種影響因素分析如下。

1 抗原抗體因素

瓊脂擴散試驗受抗原抗體本身性質、抗原抗體反應特點及其它因素的直接影響。

1.1 抗原抗體的性質

1.1.1 抗體性質 抗體的特異性與親和力是影響瓊脂擴散試驗的主要因素?？贵w的特異性是由抗體可變區的原子空間排列及其電子結構和極化特性決定的(王明俊等，1997)，親和力是復雜抗原與相應抗體之間的總的結合能力(余傳霖等，1998)?？贵w的親和力很低時不易用瓊脂擴散試驗測定。一般情況下，在免疫初期，卵黃抗體的特異性較高但親和力不高，后期，卵黃抗體的親和力高但相應的特異性變低。

1.1.2 抗原性質 抗原的種類、抗原決定簇的數目和理化性質等因素都能影響瓊脂擴散試驗的結果。瓊脂擴散試驗是利用可溶性的抗原與抗體在瓊脂凝膠網格中的水中自有擴散，相互結合形成的沉淀線來判斷結果的。這樣就要求抗原與抗體必須都是可溶性的，因為一些顆粒性的抗原如細菌、紅細胞等是不溶的，這樣的抗原相對應的卵黃抗體效價就不能用瓊脂擴散試驗來測定。在瓊脂擴散試驗中要求抗原是多價的(抗原決定簇≥2)，單價抗原不能形成抗原抗體復合物，因此不能產生可見反應?？乖姆肿恿?、pH值等理化因素也直接影響到試驗的結果。

1.2 抗原抗體的反應特征

抗原抗體反應特征影響瓊脂擴散試驗結果的因素有：抗原抗體最適比、抗原抗體反應的可逆性、抗原抗體的量。

1.2.1 抗原抗體的最適比 抗原抗體的反應雖決定于兩者的化學構型的相應性，但不同于一般的化學反應，其結合比例不完全符合化學反應的質量作用定律，因為抗原抗體的結合是一種多價相互作用的結合?？乖鶕肿哟笮〉牟煌?，結合位點變化很大，由10~50不等，有的甚至達到200個；卵黃中的抗體成份主要是IgG，有2個結合位點，卵黃抗體除了常見的雞傳染性法氏囊病抗體外，還有鴨病毒性肝炎、豬瘟(邊傳周等，1999)等高免卵黃抗體，這些抗體的效價都可以用瓊脂擴散試驗來測定。當抗原抗體的濃度比例適宜時，抗原抗體結合后尚未達到飽和的位點可與其它游離的抗原抗體繼續結合，逐漸形成越來越大的復合物。最后在抗原與抗體孔之間形成肉眼可見的沉淀線。此時反應最快、最明顯。但當兩者的量不適合時，少的一方在聚合初期就達到飽和，沉淀線變得不清晰甚至沒有沉淀線，而且沉淀線偏移，向量少的一方移動。

1.2.2 抗原抗體反應的可逆性 抗原抗體之間的結合是依靠分子間的近距離力：氫鍵、范德華力、靜電力、疏水作用力。兩者的距離越近，結合的位點越多，形成的近距離力也越大，結合的也越牢固。這些作用力在生理狀態下最大。由于抗原抗體反應是分子表面的非分子結合，所形成的復合物并不牢固，可以隨時解離，解離的抗原抗體保持原來的生物活性，可與其它的抗原抗體再一次結合，在整個反應體系中形成動態平衡，平衡式為：Ag+Ab≒AgAb。這種平衡受到溫度、pH等物理的、化學的因素的影響。當溫度大于60℃，pH值降到3以下時，由于同離子效應等因素，使抗原抗體蛋白質的近距離力遭到破壞，結構發生改變，導致抗原抗體復合物重新解離。

1.2.3 抗原抗體的總量 瓊脂擴散試驗中所形成的沉淀線的粗細、清晰度與抗原抗體的量成正比例關系?？乖磸蛢鋈芤约伴L期把它放在室溫下都使大量的抗原破裂失去活性。所以在保存與運輸抗原時應放在冷凍條件下進行。

1.3 抗原抗體本身其他因素

影響瓊脂擴散試驗結果的抗原抗體因素還包括抗原抗體的純度?？乖c其對應的抗體的反應屬于特異性反應。但是如果兩者含有過多與反應無關的蛋白質、類脂質、多糖等非特異性物質，往往抑制抗原抗體的特異性反應，而出現一些非特異性反應。

2 瓊脂因素

瓊脂擴散試驗的結果在很大程度上也受到瓊脂的成份、瓊脂板厚度、瓊脂的濃度、實驗用水質量、pH值、電解質濃度、抗原抗體孔間距離及瓊脂水分的影響。

2.1 瓊脂的成份

影響瓊脂擴散試驗結果的瓊脂成份因素主要是不溶性雜質。一些大的不溶性雜質能直接堵塞瓊脂的網格，這樣的雜質過多會影響抗原抗體的擴散，為了避免雜質的影響，應在瓊脂粉融化后用脫脂棉或紗布過濾。

2.2 瓊脂板的厚度

瓊脂板的厚度應為3mm，因為由于重力作用，加入孔中的抗原抗體會發生沉淀，導致上下層的濃度形成差，濃度大的向瓊脂網格中擴散的速度要比濃度小的快，同時又由于抗原抗體的質量與體積的差異，所以兩者形成的濃度差是不同的，擴散速度的差異也不同，如果瓊脂板很厚，同一孔上下層擴散速度差異及抗原抗體之間擴散速度的差異都很大，致使抗原抗體孔之間形成的沉淀線上下層之間就不在同一平面上，影響瓊脂擴散試驗的結果的觀察；相反如果瓊脂板太薄，所加的抗原抗體量很小，沉淀線不清晰甚至不出現沉淀線。

2.3 瓊脂的濃度

瓊脂凝膠網格允許通過物質的最大分子量與瓊脂濃度成反比見附表(吳冠蕓等，1999)。卵黃抗體IgY的分子量為1.8×105(楊婷婷等，2000)，1%~1.5%的瓊脂溶液網格能允許絕大多數大分子抗原自由擴散，大于這個濃度范圍的瓊脂網格太小不利于大分子抗原如雞馬立克氏病病毒(分子量為1.03×108)、雞傳染性喉氣管炎病毒(殷震等，1997)的擴散，濃度太小瓊脂骨架太少不利于抗原抗體復合物的沉淀，從而影響瓊脂擴散試驗的結果。

附表 瓊脂糖凝膠Bio-Gel A型的數據

型號A-0.5mA-1.5mA-5mA-15mA-50mA-150m 瓊脂糖含量%1086421 分級范圍(球蛋白)1×104~5×1051×104~1.5×1061×104~5×1064×104~1.5×1071×105~5×1071×106~1.5×108

2.4 試驗用水的質量

瓊脂擴散試驗的結果在很大程度上也受到試驗用水的影響。如果試驗用水中含大量重金屬離子如鉛、汞、銅等，會使蛋白質成份的抗原抗體變性失去活性，不能再發生特異性反應，影響瓊脂擴散試驗的結果。

2.5 pH值

抗原抗體大部分是蛋白質，蛋白質在一定的pH處所帶的凈電荷數為零，此時的pH值為蛋白質的等電點，大部分蛋白質的等電點在pH5~5.5之間，在等電點處，蛋白質分子之間靜電斥力減少，趨于凝集狀態而發生沉淀，所以蛋白質在等電點處的溶解度最低。當瓊脂的pH在抗原抗體等電點處時，抗原抗體會發生非特異性的沉淀，影響瓊脂擴散試驗的實驗結果。一般瓊脂擴散試驗的pH為6~8(比等電點稍高)(余傳霖等，1998)。當pH小于3時，往往使抗原抗體結合物變性或再次解離，如IgY在pH4.0~11.0穩定，馬立克氏病毒在pH3或pH11處理10min失活。

2.6 電解質的濃度

電解質的濃度對瓊脂擴散試驗的結果影響也很大?？乖贵w具有膠體性質，含有氨基、羧基、肽鏈等極性基團，與水相互結合，形成水化層，因為蛋白質帶有相同的電荷，所以膠體所帶電荷相同，互相排斥，在水中穩定存在，抗原抗體帶有相反的極性，等兩者結合后，表面的電荷減少或消失，水化層也減弱，由親水型變為疏水型，此時如有適當濃度的電解質，能進一步降低抗原抗體表面的電荷，促進他們沉淀，最常用的電解質為氯化鈉，哺乳動物血清學反應濃度為0.15mol，即生理鹽水，禽類8%(楊廷彬等，1994)。但過高濃度的電解質反而不利于抗原抗體沉淀物的形成，有兩個原因：（1）過高濃度的電解質阻止蛋白質與水分子的相互作用，破壞蛋白質表面的水化層，產生鹽析效應，使抗原抗體發生非特異性的沉淀。（2）過高濃度的電解質濃度(大于或等于15%)可使抗原抗體結合物離解。

2.7 抗原抗體孔間距離

抗原抗體的孔間距離也能影響瓊脂擴散試驗的結果。瓊脂擴散試驗是利用可溶性的抗原抗體在瓊脂凝膠所形成的網格中自有擴散，形成濃度梯度，在適當濃度處相互結合，形成沉淀線。當兩者之間的孔距為3mm時，抗原抗體既能形成合適的濃度梯度又能充分結合。當兩者的孔間距離過大時，雖然能形成合適的濃度梯度，但由于抗原抗體量太少卻不能充分結合，相反孔距太小，雖然結合的量很大卻不能形成合適的濃度梯度，都能影響瓊脂擴散試驗的結果。

2.8 瓊脂水分

瓊脂凝膠網格內含有大量水分，如果瓊脂板儲存時間太長或儲存環境太干燥又沒有放在密閉環境中，水分就會大量的揮發，直接影響抗原抗體擴散的效果。

3 放置條件

一些培養條件如放置溫度、放置濕度、放置時間也是影響瓊脂擴散試驗結果的重要因素。

3.1 放置溫度

影響瓊脂擴散試驗結果的溫度因素包括:放置溫度的高低與放置溫度波動情況。

3.1.1 放置溫度的高低 抗原抗體的反應速度、結合程度與反應溫度高低有密切關系，溫度高，分子運動加快，增加抗原抗體碰撞幾率，反應會加快，但當溫度超過56℃時反應速度反而變慢，溫度再高，抗原抗體復合物往往會重新解離，甚至會被破壞，例如卵黃抗體在≥65℃情況下性質就會變得不穩定，雞馬立克氏病毒從感染雞皮膚中制備的脫離細胞制劑在56℃處理30min或在60℃處理10min都能失活，傳染性法氏囊病病毒在70℃處理30min失活(殷震等，1997)。反應溫度低時，反應速度變慢，但抗原抗體結合完全，沉淀量增多，結果清晰。但溫度過低，反應無法進行，也不會出現結果。最適的反應溫度為37℃(楊廷彬等，1994)。

3.1.2 放置溫度的波動情況 瓊脂擴散試驗的培養溫度應恒定，如果波動太大，會使抗原抗體在擴散時形成不連續的濃度梯度，影響兩者產生最適比，最終影響到試驗結果。

3.2 空氣濕度

瓊脂擴散試驗是抗原抗體在瓊脂網格中的水中擴散時形成的，如果空氣中濕度太低，瓊脂中的水分很容易蒸發，使瓊脂網格中的水分減少，不利于抗原抗體的自由擴散，同時加到瓊脂孔中的抗原抗體的水分也很容易蒸發，使卵黃中的抗體及抗體被固定在孔中不容易向瓊脂凝膠中擴散。所以在培養時，往往倒置平皿，然后放在一個有濕棉紗布的有蓋搪瓷盤中，以防水分蒸發。

3.3 放置時間

瓊脂擴散的結果也受到放置時間的影響?？乖贵w在瓊脂中的擴散需要一定時間。如果放置時間太短，使抗原抗體沒有完全擴散以致結合的不充分或結合后還沒有達到沉淀的程度，導致本應形成的沉淀線沒有出現。時間太長，在室溫條件小，大量抗原抗體會失去生物活性，已經形成的沉淀帶發生解離消失而出現假像。

4 其他因素

抗原抗體加的多少、打孔后瓊脂底部融封效果都能影響瓊脂擴散試驗的結果，當抗原抗體的量加的多時，所產生的沉淀線粗，為了減小各個實驗的相對誤差，加樣時，都應加到滿而不溢程度。此外，打孔后瓊脂板底部松動，如果不加熱封好，在實驗過程中，抗原抗體就不通過瓊脂網格擴散，而是直接在底部流出，不會產生沉淀線。

總之，瓊脂擴散試驗能有效的指導養殖戶、獸醫工作者制定合理的免疫程序，但是由于受到諸多因素的影響，因此，為了得出真實的試驗結果，操作者應本著科學、嚴謹的態度進行操作，以克服不良因素的影響。

[1] 王明俊等. 獸醫生物制品學[M]. 北京: 中國農業出版社. 1997.

[2] 余傳霖等. 現代醫學免疫學[M]. 上海: 上海醫科大學出版社. 1998.

[3] 甘肅農業大學主編. 獸醫微生物學[M]. 北京: 中國農業出版社. 1999, 151.

[4] 邊傳周等. 雞抗豬瘟高免卵黃抗體的研制[J]. 中國獸醫雜志, 1999, 41.

[5] 楊婷婷等. 雞卵黃抗體(IgY)的提純及其在醫學上的應用[M]. 中國人獸共患病雜志. 2000, 76.

[6] 殷震等. 動物病毒學[M]. 北京: 科學出版社. 1997.

[7] 吳冠蕓等.生物化學與分子生物學實驗常用數據手冊[M]. 北京: 科學出版社. 1999.

[8] 楊廷彬等. 實用免疫學[M]. 長春: 長春出版社. 1994.

（2012–08–07）

S852.4+3

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1007-1733(2012)11-0080-03