嗎啡對乳腺癌MCF-7細胞生存素及livin表達的影響

錢寧，孫燦林，姜琳，趙國軍，蔣小芹，于鴻

(1.姜堰市人民醫院麻醉科，江蘇 姜堰225500;2.泰州市人民醫院麻醉科，江蘇泰州225300;3.泰州市人民醫院病理科，江蘇泰州225300)

嗎啡作為一種臨床常用的阿片類藥物，廣泛應用于終末期癌癥疼痛及各種中重度非癌癥疼痛治療，其鎮痛作用及機制已被深入研究。近年來的研究表明，嗎啡可促進腫瘤細胞的凋亡并抑制腫瘤細胞的增殖，但具體機制并不十分明了。本研究通過觀察不同濃度嗎啡對體外培養的人乳腺癌MCF-7細胞生存素(survivin)和livin表達的影響，探討其促進細胞凋亡及抑制細胞增殖的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌細胞株MCF-7(中國科學院上海細胞生物研究所)，DMEM、胎牛血清、RT-PCR試劑盒(Gibco公司，美國)，二甲基亞砜(DMSO)、四氮噻唑鹽(MTT)、Annexin V-FITC試劑盒(Sigma公司，美國)，兔抗人survivin多克隆抗體、兔抗人livin多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，ABC試劑盒(Vector公司，美國)，嗎啡(批號:110120－2，東北制藥集團公司沈陽第一制藥廠)，PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2 細胞培養及分組

人乳腺癌細胞株MCF-7培養于含10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的 DMEM 培養液，37℃，5%CO2培養箱培養。取對數生長期細胞重懸，以1×103個/ml接種在6孔板內，培養24 h，采用隨機數字表法，將MCF-7細胞隨機分為3組:對照組，不作任何處理;0.1μmol/L嗎啡組，加入終濃度0.1 μmol/L 嗎啡;1.0 μmol/L 嗎啡組，加入終濃度1.0 μmol/L 嗎啡。每組18 孔。

1.3 RT-PCR法檢測生存素和livin mRNA表達

于嗎啡孵育24 h時，每組各取18孔細胞，用Trizol抽提總RNA，逆轉錄成cDNA，等量cDNA依照本實驗室常規方法［1］進行PCR。PCR引物序列:內參照GAPDH上游5'-ACCACAGTCCATGCCATGCCATCAC-3';下游 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'，預計擴增片段長度為450 bp。生存素上游5'-GGACCACCGCATCTCTACAT-3';下游 5'-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3'，預計擴增片段長度為338 bp。Survivin反應條件:50℃逆轉錄30 min，95℃滅活逆轉錄酶15 min，94 ℃ 變性2 min，60 ℃ 復性1 min，72 ℃ 延伸 1 min，共35個循環。livin上游5'-GTCCCTGCCTCTGGGTAC-3';下游 5'-CAGGGAGCCCACTCTGCA-3'，預計擴增片段長度為368 bp。內參照及livin反應條件同上。

1.4 蛋白質印跡法檢測生存素和livin蛋白表達

于嗎啡孵育24 h時，每組各取18孔細胞，經本實驗室常規方法［2］使用細胞裂解液提取細胞總蛋白，用BCA法進行蛋白含量測定，依標準方法進行8%SDS-PAGE變性電泳，轉移至PVDF膜。PVDF膜用10%羊血清37℃封閉10 min。一抗為兔抗人survivin多克隆抗體(1∶100)，兔抗人livin多克隆抗體(1∶100)，二抗為生物素化山羊抗兔多克隆抗體(1∶500，ABC 試劑盒)。

1.5 MTT法檢測細胞增殖水平

分別于嗎啡孵育24，48及72 h時，每組各取18孔細胞，將各組細胞以1×103個/ml細胞數接種于96 孔板中，每孔加入 MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續培養 4 h，每孔加入 150 μl DMSO，震蕩 10 min，置酶標儀上檢測490 nm波長處光密度(D)值。取18孔D值的平均值表示細胞增殖水平。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

于嗎啡孵育24 h時，每組各取6孔細胞，重懸細胞，離心后棄上清，取細胞沉淀，采用Annexin VFITC試劑盒進行測定，以FACSCalibur流式細胞儀(BD公司，美國)分析，每孔重復測定3次，取平均值，計算細胞凋亡率。

1.7 定量和統計分析

凝膠電泳用凝膠成像儀進行拍照記錄，Kodak Digital Science 1D掃描分析系統測定條帶的積分光密度(ID)。采用SPSS 13.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用成組t檢驗。

2 結果

2.1 生存素mRNA和蛋白表達的改變

RT-PCR 結果顯示，與對照組相比，0.1 μmol/L嗎啡組生存素 mRNA表達顯著降低(t=18.375，P ＜0.01)，1.0 μmol/L 嗎啡組生存素 mRNA 表達亦顯著降低(t=16.241，P ＜ 0.01)，0.1 μmol/L 嗎啡組與1.0 μmol/L嗎啡組間差異無統計學意義(t=1.946，P ＞0.05)，見圖 1。蛋白質印跡結果顯示相對分子質量16 500蛋白條帶(圖2)。與對照組相比，0.1 μmol/L 嗎啡組與 1.0 μmol/L 嗎啡組生存素蛋白表達均顯著降低(t分別為12.497和15.536，P 均 ＜0.01)，0.1 μmol/L 嗎啡組與 1.0 μmol/L 嗎啡組間差異無統計學意義(t=2.183，P ＞0.05)，見表1。

表1 各組細胞生存素mRNA及蛋白表達的改變x ± s，n=18Tab 1 The expression of survivin mRNA and protein in different groups

圖1 RT-PCR法檢測生存素mRNA的表達Fig 1 RT-PCR analysis for detecting Survivin mRNA

圖2 蛋白質印跡法檢測Survivin蛋白的表達Fig 2 Western blot analysis for detecting Survivin protein

2.2 Livin mRNA和蛋白表達的改變

RT-PCR 結果顯示，與對照組相比，0.1 μmol/L嗎啡組livin mRNA表達顯著降低(t=12.458，P ＜0.01)，1.0 μmol/L 嗎啡組 livin mRNA 表達亦顯著降低(t=14.539，P ＜0.01)，0.1 μmol/L 嗎啡組與1.0 μmol/L嗎啡組間差異無統計學意義(t=2.844，P ＞0.05)，見圖3。蛋白質印跡結果顯示相對分子質量31 000蛋白條帶(圖4)。與對照組相比，0.1 μmol/L 嗎啡組與 1.0 μmol/L 嗎啡組livin蛋白表達均顯著降低(t分別為11.227和9.675，P 均 ＜ 0.01)，0.1 μmol/L 嗎啡組與 1.0 μmol/L嗎啡組間差異無統計學意義(t=1.837，P ＞0.05)，見表2。

圖3 RT-PCR法檢測livin mRNA的表達Fig 3 RT-PCR analysis for detecting livin mRNA

圖4 蛋白質印跡法檢測Livin蛋白的表達Fig 4 Western blot analysis for detecting Livin protein

表2 各組細胞livin mRNA及蛋白表達的改變x ± s，n=18Tab 2 The expression of livin mRNA and protein in different groups

2.3 MCF-7細胞增殖活性的改變

MTT 結果顯示，在嗎啡孵育 24 h 時，0.1 μmol/L嗎啡組和1.0 μmol/L嗎啡組D值比對照組均顯著降低，細胞增殖受到抑制，差異具有統計學意義(t分別為13.874 和15.367，P 均 ＜0.01)，0.1 μmol/L嗎啡組與1.0 μmol/L嗎啡組間差異無統計學意義(t=2.984，P ＞0.05)。在嗎啡孵育 48 h 及72 h 時各組間差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 MTT檢測各組細胞的D值x ± s，n=18Tab 3 MTT analysis for detecting D value in different groups

2.4 MCF-7細胞凋亡的改變

流式細胞儀凋亡檢測結果顯示，嗎啡孵育24 h 時，對照組、0.1 μmol/L 嗎啡組及1.0 μmol/L 嗎啡組凋亡率分別為(6.09±1.34)%、(12.98±3.15)%、(12.92 ±3.27)%。與對照組相比，0.1 μmol/L嗎啡組凋亡率顯著增加(t=18.375，P＜0.01)，1.0 μmol/L嗎啡組凋亡率亦顯著高于對照組(t=16.294，P ＜ 0.01)，0.1 μmol/L 嗎啡組與1.0 μmol/L嗎啡組凋亡率比較差異無統計學意義(t=2.638，P ＞0.05)。見圖 5。

圖5 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率Fig 5 Flow cytomertry for detecting cell apoptosis ratio

3 討論

Maneckjee 等［3］研究表明，0.1 ～1.0 μmol/L 嗎啡可抑制人肺腺癌細胞增殖，并促進細胞出現DNA碎裂、凋亡小體形成等凋亡的特征性變化。覃怡等［4］報道，10 μmol/L 嗎啡可抑制胃腺癌 MGC-803細胞增殖、促進細胞凋亡。Ecimovic等［5］報道，嗎啡血漿濃度0.1 mol/L即可緩解乳腺癌患者疼痛，但用于癌痛治療時，個體差異較大，因此本研究中嗎啡濃度選擇為0.1 μmol/L 及1.0 μmol/L，在上述濃度嗎啡孵育乳腺癌MCF-7細胞后，結果發現，MCF-7細胞凋亡率顯著升高，而細胞增殖顯著降低，提示嗎啡可促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡并抑制其細胞增殖，這與Maneckjee及覃怡等報道結果基本一致。

生存素和livin是凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中近年來新發現的成員，在多種腫瘤細胞中高表達，參與抑制細胞凋亡，與腫瘤發生、發展密切相關，可作為腫瘤的早期診斷及預后評估的新靶點［6］。生存素還促進細胞轉化，參與細胞有絲分裂、血管生成和腫瘤細胞耐藥性的產生［7］。研究表明，生存素和 livin主要通過抑制Caspase的活性，阻斷其級聯反應，從而抑制凋亡的進程，另外也可通過激活TAKI/JNK1信號傳導途徑或參與TNF/NF-κB信號通路而發揮抗細胞凋亡作用［8］。本實驗發現，用 0.1 μmol/L 及 1.0 μmol/L嗎啡孵育后，MCF-7細胞生存素和livin蛋白及mRNA表達均比對照組顯著減少，該結果提示嗎啡可能通過下調生存素和livin的表達而抑制乳腺癌細胞增殖、促進乳腺癌細胞凋亡。然而，對于嗎啡參與抑制惡性腫瘤的細胞增殖、促進細胞凋亡的作用機制還遠未闡明。研究表明，嗎啡除可與細胞表面Fas受體結合，通過FADD/P53信號通路促進細胞凋亡，還與TNF/NF-κB細胞凋亡信號通路存在相互作用或相互串話(cross talk)［9］。這些實驗結果提示我們，在今后進一步研究嗎啡在乳腺癌細胞增殖及凋亡中所起作用時，還必須加強Fas信號通路與其他信號通路之間的相互關系的實驗研究，才能從本質上闡明其發生機制。

［1］劉慶宏，于鴻，黃俊星，等.Smad4基因對胰腺癌細胞E-cadherin、β-catenin表達及增殖的影響［J］.中華全科醫學，2011，9(12):1831 －1832.

［2］許斌，肖蔚，焦霞，等.生存素反義寡核苷酸對乳腺癌MCF-7細胞株MMP-2及MMP-9表達的影響［J］.江蘇大學學報:醫學版，2011，21(3):203 －207.

［3］Maneckjee R，Minna JD.Opioids induce while nicotine suppresses apoptosis in human lung cancer cells［J］.Cell Growth Differ，1994，5(10):1033 －1040.

［4］覃怡，唐小曼，廖淳杰，等.嗎啡對人胃癌MGC-803細胞p53 mRNA和E2F-1 mRNA表達的影響［J］.中華麻醉學雜志，2010，30(7):840 －842.

［5］Ecimovic P，Murray D，Doran P，et al.Direct effect of morphine on breast cancer cell function in vitro:role of the NET1 gene［J］.Br J Anaesth，2011，107(6):916 －923.

［6］Xi RC，Biao WS，Gang ZZ.Significant elevation of survivin and livin expression in human colorectal cancer:inverse correlation between expression and overall survival［J］.Onkologie，2011，34(8/9):428 －432.

［7］Kita A，Nakahara T，Takeuchi M，et al.Survivin suppressant:a promising target for cancer therapy and pharmacological profiles of YM155［J］.Nippon Yakurigaku Zasshi，2010，136(4):198 －203.

［8］Yan B.Research progress on livin protein:an inhibitor of apoptosis［J］.Mol Cell Biochem，2011，357(1/2):39 －45.

［9］Lin X，Li Q，Wang YJ，et al.Morphine inhibits doxorubicin-incuced reactive oxygen species generation and nuclear factor kappaB transcriptional activation in neuroblastoma SH-SY5Y cells［J］.Biochem J，2007，406(2):215－221.