牙齒酸蝕癥實驗室評估技術的研究進展

袁 鶴 綜述;李繼遙 審校

(四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室，四川成都 610041)

牙齒酸蝕癥(tooth erosion)是指在無細菌參與的情況下，由于單純的化學作用而引起的牙齒硬組織不可逆的喪失［1］，其致病機制尚未完全明了，可由外源性和內源性因素造成。外源性致病因素包括食用酸性物質、飲料、食物、藥物和酸性環境的暴露;內源性致病因素包括胃內容物返流引起的復發性嘔吐等全身性疾?。?－4］。此外，宿主的生物學因素，如唾液、獲得性膜的形成、牙齒的結構、牙齒與軟組織的關系以及舌的運動等也可能影響牙齒酸蝕癥的發生發展［5］。當前的流行病學調查和實驗室研究均證明，大量飲用軟飲料能增加牙齒酸蝕癥發生的危險性［6－14］。牙齒酸蝕癥病人最初往往僅有牙齒的感覺過敏，以后逐漸產生實質缺損，酸蝕的形式因酸而異［15］。不同學者對牙齒酸蝕癥的臨床表現看法不一，Ganss［16］對目前根據臨床表現診斷牙齒酸蝕癥的有效性進行分析后指出:前牙的溝槽狀缺損不能用于診斷牙齒酸蝕癥;釉牙骨質界冠方淺碟狀缺損以及存在于青年人牙尖的杯狀凹陷性缺損可以作為診斷牙齒酸蝕癥的依據。

牙齒酸蝕癥的實驗室評估主要是通過測量酸蝕過程中牙齒硬組織或羥磷灰石的喪失來提示酸蝕介質的酸蝕潛力(erosive potential)。酸蝕潛力與酸蝕介質的多種因素有關，如pH值，緩沖能力(即滴定酸度)，對牙面的粘著性，螯合性，鈣、磷、氟等礦物質離子的濃度等［5］。因此，評估方法也眾多，本文就其實驗室評估技術的研究進展作一綜述。

1 化學方法(Chemical analysis)

是一種通過測量酸蝕介質處理標本前后pH值、緩沖能力、Ca2+或磷酸根濃度以及某些微量元素的變化，以評估酸蝕潛力的方法。具體方法是將牙齒硬組織或羥磷灰石暴露于酸蝕介質一段設定的時間后，對酸蝕介質進行分析，測量前后的濃度變化越大說明酸蝕潛力越強。

化學方法評估酸蝕潛力簡單易行，無需制備標本，實驗成本低，可實時比較不同處理時間下各種酸蝕介質的酸蝕潛力，且敏感性高，可以測得離子含量的微小變化，因此應用十分廣泛。如，Eisenburger［14］分別使用原子吸收光譜法和鉬酸銨法測得在3 g/L檸檬酸酸蝕后，軟化脫礦的釉質區Ca2+和磷酸根含量分別減少62%和64%。pH值和緩沖能力的測量多在研究初始階段應用pH計和酸堿滴定法進行，用于反映酸蝕介質的特性，許多文章都證實軟飲料的pH大大低于釉質溶解的臨界pH 值 5.0 ～5.5［11－13，17－19］。

但化學方法只能反映離子改變的凈效應，是一種間接測量方法，不能模擬口腔內牙齒酸蝕癥發生時，由于宿主生物學因素的存在而引起的牙體硬組織脫礦減少或發生再礦化的情況。

2 物理方法(Physical analysis)

2.1 輪廓測量法(Profilometry)

對牙齒硬組織包埋、開窗制成標本，實驗處理后，使用輪廓測量儀直接測量、比較開窗區和保護區的表面形態，得到標本表面垂直方向的喪失，從而評估酸蝕介質的酸蝕潛力。是一種簡單快捷的評估酸蝕潛力的方法，可測量較大面積牙齒硬組織表面的酸蝕情況。Rios等［18］曾將此法用于測量不同種類可樂對釉質造成酸蝕后，開窗區釉質喪失的深度。

但是，該方法也存在著不少缺點。Ren等［20］發現輪廓測量儀金屬觸針的大小影響其測量精度。Heurich等［21］也發現該方法會使釉質表面產生劃痕，從而造成對酸蝕潛力的過分評估。且該方法對牙齒酸蝕癥早期軟化的釉質表面無測量效果;標本制備的要求較高。最近提出的激光輪廓測量法，也稱為非接觸式輪廓測量法(non－contacting surface profilometry，NCSP)，可彌補接觸式輪廓測量法的不足。此法用激光代替了傳統的觸針，通過光的干涉效應建立起牙齒硬組織表面的“形態地圖”，不僅提供了傳統方法中牙齒硬組織表面垂直方向的喪失，更能體現其體積的喪失。直觀易懂，在釉質表面不產生劃痕，激光探頭可根據標本的大小進行更換，使測量的標本范圍加大。Ablal等［11］應用此法比較了4種不同乙醇飲料的酸蝕潛力。Barbour等［12］應用NCSP發現:酸蝕過程中釉質表面的喪失深度隨著酸蝕介質溫度的升高而增加。

2.2 印壓技術(Indentation)

牙齒酸蝕癥的早期表現是釉質的脫礦軟化，基于此點，印壓技術通過測量酸蝕前后釉質表面硬度的改變評估牙齒酸蝕癥。包括顯微印壓技術(microindentation)和納米印壓技術(nanoindentation)。

該技術使用金剛石探頭以一定大小的負荷和速度在釉質表面產生壓痕，脫礦軟化越明顯壓痕越大。實驗對釉質表面選3～5個點進行測量，可得到釉質表面努氏硬度(KHN)、維氏硬度(VHN)或彈性模量(Nm－2)數據。納米印壓技術能夠檢測到200 nm深度的軟化釉質薄層，同時檢測彈性形變和塑性形變，使實驗結果更加精確。

該方法應用廣泛，Barbour等［12］使用納米印壓技術發現:軟飲料溫度每升高25℃，造成釉質表面硬度降低 0.9 GPa。Rios等［18］應用顯微印壓技術比較了不同種類可樂造成釉質表面硬度的改變。Van Eygen等［19］使用顯微印壓技術發現:即使短時間飲用飲料也可能降低釉質表面硬度，飲用頻率不是表面硬度降低的決定因素。

但是，應用該技術時，要求釉質表面平滑且上下兩底面平行，需要對釉質標本表面進行打磨，增加了標本制備的難度，打磨還可能對實驗結果產生影響。

2.3 圖像分析

2.3.1 掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscopy，SEM)

利用聚焦非常細的高能電子束在試樣上掃描，激發出各種物理信息(如二次電子、背射電子、俄歇電子等)，通過對這些信息的接受、放大和顯示成像，獲得對試樣表面形貌的觀察。實驗方法是:制備標本，在實驗處理前后分別用SEM成像，就可以清晰的觀察到釉質表面形態由規則的魚鱗狀秞柱結構變為秞柱或秞柱間質礦物質溶解形成的不規則蜂窩狀、點隙狀結構，從而評估牙齒酸蝕癥。

SEM放大倍數較高，20～20萬倍之間連續可調;景深及視野大，成像富有立體感，可直接觀察試樣凹凸不平表面的細微結構;重復性好。Brown等［13］將羥磷灰石經過調味蘇打水、橙汁酸蝕后，用SEM分別觀察其表面形態，發現兩者造成的酸蝕程度相似，糾正了將調味蘇打水作為酸性飲料代用品的錯誤，為牙齒酸蝕癥的預防提出了新的建議。

2.3.2 原子力顯微鏡(Atomic force microscopy，AFP)

通過檢測微懸臂一端極小的針尖與標本之間的原子間作用力，從而獲得標本表面的微觀形貌信息的技術。常見有接觸模式和輕敲模式兩種。

此方法可連續動態的檢測物體表面的微觀信息，獲得圖像的分辨率高，成像性能好，且不受實驗環境(如真空、氣體和液體)和標本的限制，應用更加簡單方便，精確度高，可檢測到標本表面納米數量級的改變。Heurich等［21］使用AFP為標準，分別測量輪廓測量法和激光共聚焦顯微鏡在測量酸蝕釉質表面產生的劃痕深度，得出激光共聚焦顯微鏡測量酸蝕癥更加精確、快速的結論，體現了AFP在評估牙齒酸蝕癥中的優勢。

原子力顯微鏡價格昂貴，每次只能檢測小于0.5 mm×0.5 mm的區域，卻需要大約60 min的工作時間。由于測量范圍過小，為使標本的代表性增強，必須進行多點檢測。

2.3.3 X線顯微照相技術(Microradiography)

投照于標本的X線，在牙齒硬組織不同厚度和礦物質含量不同的區域透過的量不同，在底片上反映出的亮度也不同，從而得到一張牙齒硬組織礦物質含量的“地圖”。包括橫斷顯微照相技術(transverse microradiography，TMR)、縱斷顯微照相技術(longitudinal microradiography，LMR)和不依賴波長的顯微照相技術(wavelength－independent microradiography)。

雖然X線顯微照相技術主要用于齲病的研究，但也已經被應用于牙齒酸蝕癥的評估。其不僅能測量釉質喪失深度，還能測量缺損下軟化釉質礦物質的喪失量，從而得到真正的酸蝕潛力。這也是Elton等［22］將TMR作為金標準比較定量光導熒光技術和NCSP評估牙齒酸蝕癥準確性的依據。通過比較得出:前者用于測量軟化釉質礦物喪失量時準確性較高，而NCSP用于測量釉質喪失深度時準確性較高。Ablal等［11］應用 TMR等測量技術發現:暴露于4種乙醇飲料不同時間后，牛牙釉質標本均有喪失，喪失程度與飲料的pH值和酸蝕時間直接相關。

2.3.4 定量光導熒光技術(Quantitative light－induced fluorescence，QLF)

離體牙標本酸蝕前后，用微型攝像機攝取圖像，分析軟件對圖像進行分析，得出脫礦釉質的熒光喪失量與正常釉質熒光量的百分比△Q，即△Q=(Fsound－Ferosion)/Fsound×100%，計算得到酸蝕后釉質脫礦的多少，從而比較不同酸蝕介質酸蝕潛力的方法。

該方法無需制備標本，是一種很有潛力的實驗室可廣泛應用的技術手段。將其應用于評估牙齒酸蝕癥也得到了滿意效果。Ablal等［11］使用此法得到牛牙釉質標本隨4種乙醇飲料酸蝕時間的延長△Q增加，脫礦量增加。而且，QLF是目前唯一可用于臨床診斷牙齒酸蝕癥的方法:壓縮空氣吹干牙面后，使用口內攝像頭，得到酸蝕牙齒的熒光圖像，與參考牙齒的熒光圖像進行比較，使用軟件對酸蝕后釉質的脫礦程度進行計算和評分。

但是，QLF僅能測得釉質脫礦量的改變，對于釉質的喪失深度無測量效果。故僅用于測量尚無實質缺損的或存在于實質缺損下的軟化釉質脫礦量的改變。這一點在Elton等［22］的研究中有所闡述。

此外，也有學者提出了一些評估牙齒酸蝕癥的其他方法，如次級離子質譜分析法(Secondary ion mass spectroscopy，SIMS)，可變焦距3D掃描顯微鏡法［20］，激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)［21］等，其中多種方法有很大的應用潛力，值得比較分析。

3 總結

本文主要討論了幾種廣泛應用的實驗室評估牙齒酸蝕癥的技術。輪廓測量法和顯微照相技術主要用于測量進展期牙齒酸蝕癥已造成牙齒硬組織喪失時，而對于早期牙齒酸蝕癥的評估，主要采用更加敏感的技術，如印壓技術，尤其是納米印壓技術?；瘜W方法可測量不同階段的牙齒酸蝕癥，但是其只是一種間接測量方法。掃描電子顯微鏡常作為其他技術，如印壓技術等，無法直接觀察牙齒硬組織表面形態改變時的補充手段，僅能得到定性測量的結果。而原子力顯微鏡擁有定量測量和定性觀察表面形態的雙重作用，故應用前景更加廣泛。而作為唯一一種能夠同時應用于臨床測量牙齒酸蝕癥的定量光導熒光技術，可能會得到更多學者的青睞。

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