量子點為載體轉染survivinsiRNA至人舌鱗癌Tca8113細胞的研究

孫 晰 趙建江 邱小玲

南方醫科大學附屬口腔醫院·廣東省口腔醫院外科，廣東廣州 510280

人類腫瘤的發生、 發展大多是由于基因的改變致細胞凋亡的異常引起的。 人體常見的口腔腫瘤細胞中，survivin 基因的水平一般都會升高，它會抑制細胞凋亡。 細胞凋亡與增殖一樣，是一個高度可調節性的生物化學過程。 RNA 干擾 （RNA interference，RNAi）成為目前的熱點研究之一，它是多種生物體內由雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子介導的基因阻抑現象，通過導入外源或內源的dsRNA，細胞內加工后產生siRNA（小分子干擾RNA 片段）可以特異性阻滯基因的表達，使內源性mRNA 發生特異性降解，從而引起轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。

量子點（quantum dot，QD）是一種直徑在 1~100nm 的半導體納米顆粒， 而粒徑在2~10nm 的量子點可通過內吞作用進入細胞。 QD 具有特殊的光學特性， 單一種類的QD 能按照尺寸變化產生發光波長不同、顏色分明的熒光，并且這種熒光的強度和穩定性都大大優于有機熒光染料， 可以讓研究人員更長時間地觀察細胞或組織；此外，QD 具有良好的生物相容性，對細胞的毒性低。 2010 年1 月—2012 年9 月在該研究中，利用量子點作為非病毒的基因轉染載體， 對口腔鱗癌Tca8113 細胞中高表達的凋亡抑制基因Survivin 的siRNA 進行修飾并轉染至人舌鱗癌Tca8113 細胞中, 達到有效抑制survivin 基因的表達至腫瘤細胞凋亡的目的。 以期望對口腔鱗癌細胞中高表達的凋亡抑制基因Survivin 基因沉默提供理論和實踐依據，探索出一種安全，低毒，高效并可進行動態觀測的siRNA 轉運載體。

1 材料

1.1 轉染所需設備試劑

（1）人舌鱗癌 Tca8113 細胞

（3）量子點（QD605）：表面帶正電荷的水溶性量子點，4 mol/L

（4） LIPOFECTAMINE 2000 脂質體

（5） OPTI-MEM I 培養基

（6） 熒光顯微鏡：OLYMPUS，IX51

1.2 實時定量RT-PCR 所需主要試劑及設備

1.2.1 主要試劑 ①Trizol RNA 提取試劑；②氯仿；③異丙醇；④無水乙醇；⑤SYBR Green PCR Master Mix；⑥焦碳酸二乙酯（DEPC）；⑦TBE 電泳緩沖液：Tris 堿 54 g，硼酸 27.5 g，0.5 mol/EDTA(PH：8.0)20 mL，加雙蒸水600 mL，劇烈攪拌至溶解，加水至1000 mL定溶，即為5×TBE，用時加雙蒸水稀釋成0.5×TBE；⑧核酸染料。

1.2.2 主要設備 ①高速冷離心機：Heraeus，Megafuge 1.0 R；②定量 PCR 儀：ABI PRISM 7500*Sequence Detection System； ③電熱恒溫鼓風干燥箱：Heraeus，UT6； ④Eppendof 管、Tip 頭等均用 0.1%的DEPC 水浸泡過夜，用無菌蒸餾水沖洗后，高壓滅活DEPC 活性，37℃烤箱烘干備用；⑤電熱恒溫水浴鍋：Grant，OLS200；⑥凝膠成像分析系統：Tanon1600；⑦電泳儀：Tanon，DYY-6X 型；⑧純水制備系統：Millipore；⑨醫用微波爐：Galanz。

電化學直接氧化法是通過反應過程中的污染物直接與電極電子傳遞，通過陽極的高電勢進行氧化降解廢水中的有機污染物和無機污染物。在氧化過程中,污染物不同導致被氧化的程度也不相同[19]。國外一些研究學者用電化學方法處理高鹽廢水,用石墨作為實驗電極材料，研討了電氧化方法的相關參數(鹽濃度、電流密度、時間、pH等)對去除有機物的作用及影響等[20]，把處理過后的廢水應用于制革工藝，事實表明電化學氧化工藝可以用于處理高鹽廢水。

2 方法

2.1 Tca8113 細胞的培養

細胞傳代培養到3~4 代時用于實驗。

2.2 量子點介導survivin siRNA 轉染Tca8113 細胞

（1）當內皮細胞貼壁，達到80%~90%融合后，于轉染前1 d，以4×105細胞/孔接種于6 孔板，于含血清、不含抗生素的DMEM培養基中培養。轉染時，細胞融合率達到60%~70%。 細胞隨機分為三組：實驗組（量子點組）、對照組（LIPOFECTAMINE 2000 脂質體），空白組（未轉染組）。

（2）溶液 1 的配制：實驗組：237.5 L OPTI-MEM I+12.5 L QD 每孔（總體積 250 L），室溫孵育 5 min；對照組：245L OPTI-MEM I+5 L lipofectamine 2000 每孔（總體積 250 L），室溫孵育 5 min；

（3）溶液 2 的配制：245 L OPTI-MEM I+5 L siRNA 每孔（總體積 250 L）。

（4）將溶液 1 輕輕地與溶液 2 混合，室溫下孵育 20 min。 同時，將6 孔板的細胞用無血清且不含抗生素的培養基漂洗2 遍，加入 1.5 mL OPTI-MEM I。

（5）將溶液1 與溶液2 的混合液逐滴加入孔中，輕輕搖動培養板混勻。 置37℃,5% CO2培養箱中培養5~6 h 后更換含血清不含抗生素的生長培養基，置37℃,5% CO2養箱中繼續培養。

（6） 轉染24 h 后在熒光顯微鏡藍光下觀察各組細胞轉染情況并拍照，同時計算轉染率。 轉染率=（每100 個細胞中表達熒光的細胞/100）×100%

2.3 定量 RT-PCR 檢測轉染后 48h 的 Tca8113 細胞中 survivin mRNA 表達

（1）細胞總 RNA 的提取

（2）去基因組

使用 RNase-free 的 DNase（Promega），按以下體系配置反應液，37 ℃消化 30 min，65 ℃滅活 10 min。

（3）總 RNA 純度和完整性檢測

①純度檢測：取 1 μL RNA 樣品60 倍稀釋，在BioPhotometer plus 艾本德核酸蛋白測定儀上測定OD 值，OD260/OD280 的比值＞1.8，說明制備的RNA 較純，無蛋白質污染。

②總 RNA 完整性檢測： 取 RNA 樣品 1 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳80V×20 min， 用凝膠成像系統觀察總RNA 的5s rRNA，18 s rRNA 和28 s rRNA 條帶，三條條帶完整的話即可證明總RNA 抽提比較完整。

（4）逆轉錄

（5）定量 PCR

①檢測序列片段大??；內參片段: 18SrRNA-112 bp，目的片段: survivin -180 bp (GeneID: 332)。

②設 計的引物 ：qh- survivin-F1: 5’ AAATGACTTGGCTCGATGCT；qh- survivin-R1：5’ TCCATCATCTTACGCCAGACT。

③反應體系：

表1 反應體系

（4）反應條件： 95℃ 5min,

融解曲線分析：溫度 60~95 ℃

每個樣重復3 次。

3 結果

3.1 量子點組與 lipofectamine 組轉染 survivin siRNA 至 Tca8113細胞的情況

熒光顯微鏡下觀察到細胞內有綠色熒光表達， 說明標記有FAM 綠色熒光的siRNA 有效轉染入Tca8113 細胞中， 組間轉染率差異不明顯（圖1、2）。

圖1 熒光顯微鏡下實驗組細胞轉染情況（×100）

3.2 實時定量 RT-PCR 檢測轉染后 Tca8113 細胞中 survivin mRNA 的表達情況

各組轉染后48 h 實時定量RT-PCR 檢測各組細胞survivin mRNA 的相對表達量。 表2 可見： 轉染 48 h 后 Tca8113 細胞中實驗組、對照組survivin mRNA 的相對表達量只有空白組的0.36 倍、0.1 倍，表達水平均有下降。 見圖3。

表2 實時定量RF-PCR 檢測轉染后Tca8113 細胞中survivin mRNA的表達情況

圖2 熒光顯微鏡下實對照組細胞轉染情況（×100）

圖3 轉染48 h 后survivin 的相對表達量

4 討論

激光共聚焦顯微鏡證實了量子點為載體可以成功轉染survivin siRNA 至Tca8113 細胞（圖2）以及量子點的使用范圍在安全范圍內， 接下來本實驗通過實時定量RT-PCR 技術檢測轉染后Tca8113 細胞內survivin mRNA 表達量下降的百分比，本實驗設立lipofectamine2000 脂質體這一經典轉染載體作為對照組。實驗組用 50 pmolQD 轉染 100 pmol survivin siRNA 入 Tca8113 細胞48h 后，檢測到survivin siRNA mRNA 表達量相對于空白組下降 64%，QD 與 siRNA 的使用比例為 1∶2（圖1）；對照組中用 100 pmol lipofectamine2000 脂質體轉染 100 pmol survivin siRNA 入Tca8113 細胞 48h 后， 檢測到 survivin siRNA mRNA 表達量相對于空白組下降 90%，QD 與 siRNA 的使用比例為1∶1（常規比例）。因此，本實驗QD 的用量為經典轉染載體lipofectamine2000 脂質體參考使用量的一半， 對靶細胞Survivin 基因的沉默率超過lipofectamine2000 脂質體的一半，這些結果表明，量子點在可觀察性和沉默率方面都表現了良好的特性。

survivin 基因是凋亡抑制蛋白基因家族的一個新成員, 鑒于該蛋白在腫瘤細胞凋亡和增殖中的重要作用,自發現以來已經成為人類基因組中眾多腫瘤特異基因的代表之一,其蛋白因其特殊生物學功能被認為是針對腫瘤治療的一個強有力的靶分子。survivin 的主要生物學功能就是抗凋亡, 它是目前已知作用最強的凋亡抑制蛋白。

RNA 干擾（RNA interference,RNAi） ，如今已成為分子生物學領域最熱門的研究課題之一。 RNA 干擾是指在生物體內，通過外源性或內源性雙鏈RNA 引發的序列特異性基因沉默，在此過程中長雙鏈RNA 被Dicer 識別加工后， 成為只具有21~25 nt長度的短雙鏈RNA 即 SiRNA, SiRNA 是RNAi 過程中的效應分子，與某些核蛋白酶形成一個復合體（RISG），RISG 再通過SiRNA 的反義鏈識別具同源序列的 mRNA 并使其降解，從而導致特定基因基因沉默[1]，由于RNAi 具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此RNAi 可以作為一種強有力的研究工具， 用于功能基因組和基因治療的研究。 2002 年 12 月 20 日, Si RNA & RNAi 被 Science 雜志評為年度十大科技成就之首，Nature 雜志亦將Si RNA 評為年度重大科技成果之一。

盡管RNAi 技術飛速發展，但在機制研究和應用方面還存在著許多問題。 在應用研究領域，最主要的問題還是轉運系統的選擇。目前轉運SiRNA 至細胞內主要通過病毒或非病毒載體，對于病毒載體，如慢病毒，腺伴隨病毒等，雖然高效，但是安全性和毒性限制了它的發展[2-3]；對于非病毒載體，他們的低效率是限制他們使用的主要因素[4]。 有學者研究[5]，有機熒光修飾 SiRNA 后轉運，通過熒光顯微鏡進行動態觀察，但是，5~10 s 熒光信號就喪失了一半多。最重要的是，長時間同時追蹤和監測多種SiRNA 的轉運，觀察基因沉默是一件非常困難的事。 因此，發現一種安全，低毒，高效和自我追蹤和監測多種SiRNA 的轉運載體非常迫切。

近年來，隨著納米技術，生物技術與材料技術的飛速發展，量子點(QD)作為生物分子的熒光檢測，特別是為多種分子同時實時動態檢測提供了可能。 量子點表現出獨特的光學特征，目前研究證實：量子點的發光特性具有以下特點[6-11]：①量子點的激發光波的范圍寬且連續分布，而發射波長的范圍窄且對稱分布，斯托克斯（Stokes）位移大，不同量子點或同一材料不同粒徑的量子點在同一光源下發射出不同的顏色的光，即發射光譜不出現交疊，或只有很少交疊， 這使得不同粒徑量子點標記的各類分子容易區分，識別。 量子點的發光特征具有嚴格的量子點尺寸效應，通過改變量子點粒徑大?。◤?.8~7 nn）可獲得從紫外到近紅外范圍或從藍色到紅色波長范圍內任意點的光譜， 這些光學特征十分適合修飾多種SiRNA 后轉運，同時觀察基因沉默的情況。 ②量子點熒光產率高，發光強度強，光化學穩定性好，不易被光解或漂白，它的發光強度是目前用的有機熒光強20 倍，光化學穩定性則提高了100 倍以上。 這可對SiRNA 轉運后基因沉默長時間觀察。 綜上所述，量子點因其特殊的光學特性不僅可對siRNA 轉染過程進行實時動態觀察， 并且能夠有效的抑制Tca8113 細胞survivin mRNA 的表達，因此量子點有望作為RNA 干擾技術的新型載體。

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