濃香型白酒產糖化酶菌株篩選及產酶條件研究

馮瑞章，龐建義，王 濤 *，游 玲

（1.宜賓學院 發酵資源與應用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓 644000）

濃香型白酒的生產依賴于生產環境內眾多微生物的協同參與。微生物作用下高分子化合物的降解、代謝產物的相互作用是決定白酒產量和品質的關鍵因素[1-3]。糖化酶又稱為淀粉酶（amylase），是葡糖淀粉酶（glucoamylase EC.3.2.1.3）的簡稱，主要由釀造環境中的霉菌代謝產生[4-6]。因該酶能夠將淀粉水解為葡萄糖而在濃香型白酒釀造中發揮重要作用，行業內普遍認為淀粉質原料糖化發酵不完全是濃香型白酒產酒率偏低的主要原因[7-9]。隨著白酒工業的發展，利用糖化酶作為糖化劑提高白酒出酒率，已被眾多白酒企業普遍采用[10]。因此，篩選優良產糖化酶菌株，對濃香型白酒生產降低能源消耗和生產成本具有重要意義。

本研究對分離自宜賓多糧濃香型白酒曲房空氣的產糖化酶菌株進行篩選，對產酶能力較強的1株菌進行產酶條件研究，以期獲得高產糖化酶的菌株及其適宜的產酶條件，為擴大微生物菌種資源的開發和微生物糖化酶的生產應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

分離自宜賓濃香型白酒曲房空氣中的14株霉菌菌株，于宜賓學院發酵資源與應用四川省高校重點實驗室保存。

1.2 培養基

（1）透明圈培養基[11]：可溶性淀粉10g、瓊脂20g、蒸餾水1000L，自然pH值。

（2）發酵搖瓶培養基[11]：碳源10g、NaNO32g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、蒸餾水1000mL，自然pH值。

1.3 方法

1.3.1 高產糖化酶菌株的篩選

將保存菌株活化后，制備孢子懸液，調整濃度至107CFU/mL，點接10μL 于透明圈培養基上，37℃培養6d，檢測菌落直徑（d）及其周圍透明圈直徑（D）的大小，計算D/d 值，篩選D/d 值最大的1株菌進行酶學特征研究。

1.3.2 菌株糖化酶活力測定

于150mL三角瓶中裝入50mL液體發酵培養基，接種1mL濃度為107CFU/mL的孢子懸浮液，30℃、130r/min培養5d，發酵結束以后，取發酵液于離心管中，在6000r/min離心10min，收集上清液即為粗酶液。按照張娥等[12]及MICHELINM等[13]的方法，將糖化酶分離純化。經分離純化的糖化酶按照GB 8276—2006《糖化酶制劑》中要求測定[14]。酶活力的定義：在分析條件下，1mL粗酶液1h水解底物釋放出1mg葡萄糖的酶量為1個酶活單位，用U/mL表示[15]。

1.3.3 菌株糖化酶發酵特征研究

于150mL三角瓶中裝入50mL分別以可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、小麥粉和玉米粉為碳源的液體發酵培養基，如1.3.2所述方法接種糖化酶菌株，培養4d后測定糖化酶活力。

1.3.4 初始pH值的影響

于150mL三角瓶中裝入50mL液體發酵培養基，調節初始pH值為分別為4、5、6、7、8、9、10，接種糖化酶菌株，培養4d后測定糖化酶活力。

1.3.5 發酵溫度的影響

于150mL三角瓶中裝入50mL液體發酵培養基，接種1mL濃度為107CFU/mL的孢子懸浮液，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃條件下搖床培養4d，測定糖化酶活力。

1.3.6 溶解氧的影響

同一規格和型號的150mL三角瓶中盛入不同體積（25mL、50mL、75mL、100mL、125mL）的液體發酵培養基，接種糖化酶菌株，培養4d后測定糖化酶活力。

1.3.7 菌株的耐受酒精性

于150mL三角瓶中裝入50mL液體發酵培養基，調節酒精度分別為2%vol、5%vol、8%vol、12%vol、16%vol，接種糖化酶菌株，培養4d后測定糖化酶活力。

1.4 數據分析

用Excel 2003和SPSS13.0軟件對實驗數據進行方差分析和顯著性測驗。

2 結果分析

2.1 高產糖化酶菌株篩選

透明圈直徑（D）、菌落生長直徑（d）及其比值是表征菌株糖化酶能力高低的一個指標。將14株糖化酶菌株分別接種于透明圈固體培養基上培養6d后（見表1），發現9株菌可以產生明顯的透明圈（D≥1.60cm），其中J8M-53 菌株產生的透明圈最大（2.70cm），D/d值可達到1.74，說明該菌株產糖化酶能力明顯高于其他菌株。因此，選擇J8M-53菌株作為出發菌株，進一步研究其產酶條件。

表1 產糖化酶菌株篩選Table 1 Screening of highly glucoamylase-producing strain

2.2 發酵時間對菌株發酵產糖化酶活力的影響

將J8M-53菌株接種于發酵培養基中培養，考察培養時間對該菌株產糖化酶能力影響，結果見圖1。隨發酵時間的延長，糖化酶活性逐漸增加，培養96h后，酶活達到最高值，隨著發酵時間的繼續增加，糖化酶活性呈逐漸下降趨勢。值得注意的是，在發酵初始階段（0～48h），酶活力增加相對緩慢，48h以后，其活性迅速增加，72h和96h時的酶活分別為24h時酶活性的5.8和7.2倍，為48h時酶活性的2.8和3.6倍；在96h～144h時，酶活性降低速度相對緩慢，說明糖化酶發揮作用的時間段較長。

圖1 菌株產糖化酶動態Fig.1 The glucoamylase activity trend of J8M-53

2.3 培養條件對菌株發酵產糖化酶活力的影響

圖2 培養條件對菌株發酵產糖化酶能力的影響Fig.2 Effects of different culture condition on the glucoamylase activity of J8M-53

由圖2（A）可知，雖然pH值為5.0時菌株產酶效果最好（酶活力為853U/mL），但初始pH值為4.0時，菌株依然有較強的產酶能力（635U/mL），為最大值的74%，說明該菌株有一定的耐酸能力，符合濃香型白酒生產對菌株耐酸性的要求。當初始pH值大于6以后，糖化酶活性急劇降低。

發酵溫度對菌株糖化酶活性的影響見圖2（B），在一定溫度范圍內（15℃～30℃），菌株糖化酶活性與溫度增加呈正相關，當發酵溫度為30℃時，糖化酶活性達到峰值，溫度超過這一閾值后，糖化酶活性開始下降，當培養溫度為35℃和40℃時的酶活性分別為最大酶活性的91%和73%，說明該菌株能耐受相對的高溫。

菌株在不同碳源培養條件下糖化酶活性產生明顯差異。由圖2（C）可知，不同碳源條件下糖化酶活性大小依次為可溶性淀粉＞葡萄糖＞蔗糖、小麥粉＞乳糖、玉米粉。雖然小麥粉和玉米粉作為碳源時的糖化酶活性較低，僅分別為最大值的57%和34%，但與其他碳源不同，這兩種物質為菌株生長和代謝提供碳源的同時，也是氮源的來源，因此，結合實際生產，這兩種物質發揮的作用將更為重要。

在不同的裝液量下，菌株都有一定的產酶能力，說明該菌株不是專性好氧或專性厭氧微生物。由圖2（D）可知，該菌株在裝液量為75mL時表現最大酶活性，且在裝液量為25mL和50mL時的酶活性顯著高于裝液量為100mL、125mL時的酶活性，說明該菌株屬于好氧菌或者兼性厭氧菌，對氧的需求量較大，相對缺氧的環境將抑制其酶活性的發揮。

作為濃香型白酒生產中將淀粉水解為葡萄糖的產糖化酶菌株，需要具有一定耐酒精能力。J8M-53菌株產糖化酶的能力大小對低酒精度有一定的依賴性，高酒精濃度則對菌株的產糖化酶能力表現抑制效應。研究菌株產糖化酶活力（y）與發酵液酒精濃度（x）的相互關系發現二者呈現二次函數關系（y=-35.803x2+284.23x+542.83，R=0.967）。當酒精濃度為6%vol時糖化酶活性達到最高值（1185U/mL），此后，隨著酒精濃度的增加，糖化酶活力逐漸下降，但當酒精度為12%vol 時，菌株產糖化酶的能力還保持在較高水平，該酒精濃度下的酶活力約為最高酶活力的74%，說明該菌株對酒精具有較高的耐受性。

3 結論

本研究通過透明圈法從來自濃香型白酒生產環境的14株真菌中篩選得到1株產糖化酶能力較強的菌株，以液體培養的方式，探索了培養時間對該菌株產糖化酶能力的影響，確定最佳產酶時間為96h。通過單因素試驗研究pH值、培養溫度、碳源及溶解氧對菌株產糖化酶的影響，發現該菌株產酶的最適初始pH值為5，但在初始pH值為4時糖化酶活性為最大值的74%；最適培養溫度為30℃，但溫度達到40℃時的糖化酶活性最大值的74%；最適的碳源為可溶性淀粉，但對其他碳源都有一定的利用；該菌株屬于好氧菌或者兼性厭氧菌，相對缺氧的環境將抑制酶活性的發揮。菌株產糖化酶的能力對培養液的酒精濃度有一定的依賴性，當培養液的酒精濃度為6%vol時，酶活力可以達到1185U/mL，酒精濃度為12%vol時，酶活可以達到873U/mL，約為最大值的74%。

綜上所述，J8M-53菌株具有較好的環境適應能力，在一定程度上具有耐酸、耐高溫、耐酒精及碳源利用率廣泛的特點。因此，在濃香型白酒生產中，如能合理利用，將在提高濃香型白酒的原料利用率和出酒率方面發揮重要作用。

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