黃酮類化合物與α-羥乙基過氧自由基反應的脈沖輻解研究

張福根 周瀚洋 彭 靜 吳季蘭

(北京大學化學與分子工程學院應用化學系，北京100871)

1 引言

生物體新陳代謝過程中會產生大量的自由基，這些自由基可以與不飽和脂肪酸反應生成脂質過氧自由基，而脂質過氧化反應(LPO)是導致許多病理現象的主要原因.1研究發現，廣泛存在于植物界、含有γ-吡喃酮母體結構的低分子量黃酮類化合物是有效的自由基清除劑和LPO抑制劑.2-5目前對于黃酮類化合物與過氧自由基反應的機理主要有以下兩種觀點:一種比較流行的觀點是單電子氧化機理，6-9即過氧自由基與黃酮類化合物發生電子轉移反應，并奪取酚羥基的氫，生成的酚氧自由基再失去電子，生成醌類化合物(如圖1所示)，同時過氧自由基由于得到了電子或氫原子而被還原.在這個過程中，黃酮類化合物結構中B環鄰二羥基是必要的結構，而其它要素如A環羥基和C環雙鍵不起作用或只起促進電子離域的作用，不直接參與反應.但這一機理不能解釋B環無羥基的黃酮類化合物如黃岑甙也能有效地清除過氧自由基.10-13此外，也缺少符合物料平衡的終產物分析.

另一種觀點14-18認為過氧自由基可與共軛雙鍵或黃酮類化合物的C環雙鍵發生加成反應，加成產物再通過分解或重排等后續反應生成最終產物(如圖2所示).

圖1 黃酮類化合物與過氧自由基反應的單電子氧化機理Fig.1 One-electron oxidation between flavonoids and peroxyl radicals

圖2 黃酮類化合物與過氧自由基的雙鍵加成反應Fig.2 Possible conjugate addition reaction between flavonoids and peroxyl radicals

究竟以上兩種機理哪個更主要，目前還不清楚.因此研究不同結構的黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應速率有助于闡明該反應的化學機理.由于許多黃酮類化合物在中性水溶液中的溶解度很低，若滴加堿使之溶解，則體系的pH遠遠偏離生理條件下的pH，因此我們選擇乙醇作為溶劑來研究黃酮類化合物與有機過氧化自由基的反應.在空氣或氧氣飽和的乙醇中，經過電離輻射后會生成α-羥乙基過氧自由基，可作為有機過氧自由基的模擬物來研究黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應.對于α-羥乙基過氧自由基的自身衰減以及它與黃酮類化合物的反應已有報道，19-24但反應多在乙醇的水溶液中進行，仍難以解決溶解度的問題，同時對于α-羥乙基過氧自由基在純乙醇中的衰減只近似作為二級反應動力學處理，忽視了其實際蛻變過程為一級和二級反應混合類型.

用脈沖輻解的方法可以選擇性地產生單一的自由基粒種，并檢測其在很短時間內的變化，從而使自由基反應的動力學研究成為可能.25-27我們28已經報道過在乙醇溶液中用脈沖輻解的方法研究α-羥乙基過氧自由基的自身衰減動力學，并得到了其衰減的一級和二級動力學常數.本文繼續在乙醇溶液中用脈沖輻解的方法詳細研究了α-羥乙基過氧自由基與幾種典型的黃酮類化合物以及模型化合物的反應動力學.

2 實驗部分

圖3 實驗中所用黃酮類化合物的結構Fig.3 Chemical structures of flavonoids used in this work

實驗中所用的幾種黃酮類化合物的化學結構列于圖3.所用試劑為槲皮素(quercetin，生化試劑，純度≥95%，Sigma公司產品)，蘆丁(rutin，生化試劑，上海試劑二廠，使用前用三次蒸餾水重結晶)，黃岑甙(baicalin，化學對照品，中國藥品生物制品檢定所，使用前用乙醇重結晶)，兒茶素(catechin，純度≥99.0%，Sigma公司產品)，黃酮體(flavone，ACROS公司產品)，鄰苯二酚(pyrocatechol，分析純，中國軍事醫學科學院藥材供應站)和乙醇(優級純，北京化工廠).

脈沖輻解采用微秒級脈沖輻解裝置(北京師范大學低能物理研究所).29每次輻照前用N2O飽和的硫氰化鉀溶液測定脈沖劑量，取Gε480nm[(SCN)2-]=4.41×102eV-1·mol-1·dm3·cm-1(其中，G 為輻射化學G值，即物質每吸收100 eV所變化的分子數.ε480nm表示在480 nm處的摩爾吸光系數).用Igor一級和二級混合反應處理程序30對得到的脈沖輻解數據進行動力學處理.

3 結果與討論

3.1 α-羥乙基過氧自由基與幾種典型的黃酮類化合物的反應

在受到電離輻射時，空氣或氧氣飽和的乙醇溶液中會產生α-羥乙基過氧自由基.30在脈沖輻解條件下，由于劑量率很大，α-羥乙基過氧自由基濃度較高，它主要通過單分子和雙分子兩種方式衰減，一級與二級衰減的速率常數分別為k1和k2.28

在260-300 nm范圍內，α-羥乙基過氧自由基的最大吸收在270 nm處(圖4內插圖)，但黃酮類化合物一般在285 nm處吸收最低，為了最大限度地降低黃酮類化合物對過氧自由基吸收的干擾，我們選擇了285 nm作為檢測波長，研究黃酮類化合物的乙醇溶液中有機過氧自由基的動力學行為.

不同濃度的槲皮素乙醇溶液中α-羥乙基過氧自由基的衰減擬合曲線如圖4所示.由圖4可見，隨著槲皮素濃度增加，過氧自由基的衰減速度明顯加快.

在黃酮類化合物的乙醇溶液中，經過電離輻照產生的α-羥乙基過氧自由基除了通過一級和二級兩種方式衰減之外，還會與黃酮類化合物發生反應:

圖4 槲皮素濃度對α-羥乙基過氧自由基在乙醇中衰減曲線的影響Fig.4 Effect of concentrations of quercetin on the decay of α-hydroxyl ethyl peroxyl radicals in ethanol

當槲皮素的濃度遠遠大于有機過氧自由基的濃度時，式(4)可簡化為:

式中表觀一級反應速率常數

用Igor脈沖輻解數據處理程序對測得的數據進行處理，得到槲皮素不同濃度下的表觀一級反應速率常數k*

1，對槲皮素濃度作圖，得到一條直線(圖5a)，直線的斜率即為槲皮素與有機過氧自由基反應速率常數k3，直線的截距則為有機過氧自由基單分子衰減的速率常數k1.本文中其它幾種黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應也采用同樣的方法處理，結果如圖5所示.

從圖5中得到4種黃酮類化合物與α-羥乙基過氧自由基反應的速率常數k3，列于表1中.

由表1可知，(1)槲皮素和蘆丁與有機過氧自由基的反應非?？?，同時，比較二者結構可知，C環C3-醣甙的存在與否對反應影響不大;(2)當A環含有C5羥基與C環C2＝C3以及B環鄰二羥基共存時可以明顯提高反應速率;(3)不含有B環鄰二羥基的黃岑甙與有機過氧自由基的反應速率常數接近于蘆丁以及槲皮素的反應速率常數，而含有B環鄰二羥基結構的兒茶素與有機過氧自由基的反應速率常數則要小近1個數量級.這表明在黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應中，C環C2＝C3雙鍵或B-C環大π共軛鍵的抗脂質過氧化性好于B環的鄰二羥基.

圖5 α-羥乙基過氧自由基的表觀反應速率常數與黃酮類化合物濃度關系Fig.5 Relationship between apparent decay rate of α-hydroxyl ethyl peroxyl radicals and concentration of flavonoids

3.2 α-羥乙基過氧自由基與模型化合物的反應

為了進一步闡明黃酮類化合物的結構官能團在與有機過氧自由基的反應中所起的作用，我們又選擇了兩種黃酮類化合物的模擬物:黃酮體以及鄰苯二酚，測定了它們與α-羥乙基過氧自由基反應的速率常數，結果如圖6所示.

從圖6得到黃酮體和鄰苯二酚與α-羥乙基過氧自由基反應的速率常數分別為(1.7±0.1)×106和(2.9±0.1)×105mol-1·dm3·s-1，見表1.作為2，3-雙鍵模型化合物的黃酮體比作為鄰二羥基模型化合物的鄰苯二酚與有機過氧自由基的反應要快1個數量級.這進一步證明了在黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應中，C環C2＝C3或B-C環的大π共軛鍵的作用大于B環的鄰二羥基.因此可以推斷反應過程中，主要是C環C2＝C3或B-C環的大π共軛鍵與過氧自由基發生雙鍵加成反應，而A環C5位羥基在共軛體系中會給環提供電子，對其活性有一定的促進作用.該結果與我們前期對蘆丁與α-羥乙基過氧自由基的反應產物的研究結果18相符合，我們通過分離分析得到蘆丁與α-羥乙基過氧自由基的產物主要是來自于C、B環斷開形成的2種產物，我們曾經推測是由于C環C2＝C3或B-C環的大π共軛鍵比較活潑，與過氧自由基反應重排后形成.

表1 黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應速率常數Table 1 Rate constants of the reactions between flavonoids and α-hydroxyl ethyl peroxyl radicals

圖6 α-羥乙基過氧自由基的表觀反應速率常數與模型化合物濃度關系Fig.6 Relationship between apparent decay rate of α-hydroxyl ethyl peroxyl radicals and concentrations of model compounds

因此，由表1可知，清除α-羥乙基過氧自由基反應的活性順序為:蘆?。鹃纹に兀军S岑甙＞兒茶素＞黃酮體＞鄰苯二酚.該順序與其體外清除脂質過氧自由基的效果31，32基本一致.文獻32報道，在乳化劑存在下，pH=7.8，37°C條件下得到的清除脂質過氧自由基的活性順序為:蘆?。鹃纹に兀緝翰杷兀距彵蕉?Lu等33利用老鼠心臟做體外實驗，詳細研究了黃酮類化合物的抗脂質氧化作用，發現在葡萄糖-葡萄糖氧化酶誘發的脂質氧化反應中，抗氧化劑的有效性是:槲皮素最好，蘆丁、黃岑甙和兒茶素差不多.可見，實際生物體系比較復雜，但抑制LPO的大致規律與抗氧化劑的抗氧化活性基本一致.最近，Xiao等34研究了多種黃酮類化合物結構對其與α-淀粉酶親和性的影響，發現C環C2＝C3結構有利于提高化合物與α-淀粉酶的親和性，主要是由于該結構連接B環和C環而形成對位共軛效應，有利于兩環形成近平面結構，而該結構容易進入蛋白質中疏水性的囊腔內.所以，在脂質抗氧化過程中，黃岑甙的抗氧化活性好于兒茶素可能也與其親和性好有關.

4 結論

通過脈沖輻解法測定了4種典型黃酮類化合物(槲皮素、蘆丁、兒茶素以及黃岑甙)和2種模型化合物與α-羥乙基過氧自由基反應的速率常數，發現它們清除α-羥乙基過氧自由基反應的活性順序為:蘆?。鹃纹に兀军S岑甙＞兒茶素＞黃酮體＞鄰苯二酚.研究表明，含有A環C5、C7羥基，C環C2＝C3或B-C環的大π共軛鍵以及B環鄰二羥基的黃酮類化合物可以快速地清除α-羥乙基過氧自由基.其中，A環C5羥基，B環鄰二羥基，C環C2＝C3或B-C環的大π共軛鍵結構共存的黃酮類化合物反應速率最快，而且C環C2＝C3雙鍵或B-C環的大π共軛鍵結構的作用大于B環鄰二羥基結構，而C環是否含有C3-醣甙結構沒有明顯影響.因此我們認為在抑制LPO過程中，黃酮類化合物中的C環C2＝C3結構起主要作用.

致謝: 本工作得到了北京師范大學的劉安東教授和李鳳梅教授的幫助，在此表示感謝.

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